高血壓是最常見(jiàn)的一種全球性的疾病。血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(Angiotensin-converting enzyme,ACE)是血壓升高的關(guān)鍵因素。它可以將血管緊張素I(十肽)水解為血管緊張素II(八肽)。血管緊張素II能夠結(jié)合血管平滑肌和內(nèi)皮細(xì)胞上的AT1受體,導(dǎo)致血管收縮。它還使內(nèi)皮依賴性血管舒張緩激肽酶失活,從而導(dǎo)致高血壓。ACE抑制肽是一類從食物中提取的具有降高血壓活性的多肽,通過(guò)抑制ACE的活性進(jìn)而抑制血壓的升高。本文主要研究了胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶水解乳清蛋白制備ACE抑制肽的方法,確定了胃蛋白酶和胰蛋白酶水解乳清蛋白的最佳工藝條件。將水解物以3kD超濾膜過(guò)濾,并用Sephadex G-15進(jìn)一步純化。利用納升級(jí)反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nano RPLC-MS/MS)對(duì)純化后樣品(組分B1)進(jìn)行多肽結(jié)構(gòu)鑒定。研究結(jié)果如下:(1)研究并優(yōu)化了以乳清蛋白為原料,胃蛋白酶水解乳清蛋白制備ACE抑制肽的工藝。通過(guò)單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)證明,當(dāng)水解溫度37℃、酶與底物比1:100、底物濃度6%時(shí),胃蛋白酶水解乳清蛋白制備所得的ACE抑制肽對(duì)ACE的抑制率最高,ACE抑制率為86%。再將胃蛋白酶最佳水解條件下得到的產(chǎn)物進(jìn)行胰蛋白酶水解,當(dāng)水解溫度55℃、底物濃度6%、酶和底物比值1:500時(shí),胰蛋白酶水解乳清蛋白制備所得的ACE抑制肽對(duì)ACE的抑制率最高,ACE抑制率為72%。最終,胃蛋白酶和胰蛋白酶雙酶水解物的IC50值為425.66μg/mL。(2)研究了乳清蛋白的酶解物的分離純化工藝。采用超濾技術(shù)對(duì)乳清蛋白進(jìn)行分離,得到三個(gè)組分,A1(10 kD)、A2(3~10 kD)和A3(3 kD)。三種組分中,A3的ACE抑制率最高,為92%,其IC50值為327.28μg/mL。組分A3通過(guò)Sephadex G-15(葡聚糖凝膠過(guò)濾層析色譜)分離得到2個(gè)組分,B1和B2。組分B1的ACE抑制率為97.5%,顯著高于B2組分的ACE抑制率83%(P0.05),B1的IC50值為273.82μg/mL。(3)采用納升級(jí)反相液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜(nano RPLC-MS/MS)對(duì)純化后的乳清蛋白酶解物B1組分進(jìn)行結(jié)構(gòu)鑒定,得到73條多肽序列。根據(jù)ACE抑制肽普遍為短肽,選7條多肽序列(VLVLDTDY、LSPNPTQLE、DLEILLQK、DEALEKFD、LDAQSAPLR、MAASDISL、LIVTQTMK)。用固相合成的方法合成以上7條多肽。經(jīng)檢測(cè),只有LIVTQTMK有ACE抑制活性,其IC50值為248.1μg/mL。(4)采用分子對(duì)接技術(shù)研究了ACE抑制肽LIVTQTMK與ACE酶的相互作用。結(jié)果表明,靜電力和疏水作用是LIVTQTMK與ACE結(jié)合的主要驅(qū)動(dòng)因素。其中,LIVTQTMK的Leu1和Lys8的質(zhì)子化N原子分別與ACE的Asp77和Asp237的羧基形成鹽橋作用,Met7的羧基和Gln5的骨架氧原子分別與Arg124和Arg415的胍基形成鹽橋作用;Gln5與Tyr231和Trp235,Thr6與Thr131以及Met7與Asn417形成強(qiáng)弱不同的氫鍵(氫鍵長(zhǎng)度為2.8~3.5?)
【學(xué)位單位】：天津商業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ464.7;O657.63
【部分圖文】：

A 代表反應(yīng)體系中加入 ACE 抑制劑時(shí)的吸光度；BCE 與 HHL 反應(yīng)時(shí)的吸光度，即對(duì)照；C 代表空白反應(yīng)的吸光指 ACE 催化的酶反應(yīng)被抑制一半時(shí)，抑制劑的濃度。IC50 值配制成不同質(zhì)量濃度梯度的溶液，并測(cè)定各個(gè)溶液的 ACE 抑的 ACE 抑制率輸入到 Graph Pad Prism5 統(tǒng)計(jì)軟件中進(jìn)行計(jì)算處理xcel 2007、Origin 8.5、Graph Pad Prism5、SPSS 對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行處 SPSS 20.0 軟件分析試驗(yàn)結(jié)果。與討論力法 2.3.2 繪制酪氨酸標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見(jiàn)圖 2-1。由標(biāo)準(zhǔn)曲線可知計(jì)算得到胃蛋白酶活力為 260U/mg，胰蛋白酶活力為 261U/

蛋白酶解液的 ACE 抑制率為 80.35%，A1 組分的 ACE 抑制率為CE抑制率為84%，A3組分的ACE抑制率為92%，顯著高于其他組分擇A3 組分進(jìn)行下一步分離純化。經(jīng)計(jì)算，A3組分的 IC50 值為327.2表 3-3 酶解物不同組分的 ACE 抑制活性Table 3-3 ACE inhibitory activity of different components of enzymatic hydrol組分 ACE 抑制率（%）粗酶解物 80.35A1 68A2 84A3 96phadex G-15 凝膠過(guò)濾層析色譜分離乳清蛋白酶解物

圖 5-1 LIVTQTMK 分子動(dòng)力學(xué)模擬 RMSD 圖Fig. 5-1 The RMSD image of molecular dynamics simulation of LIVTQTMK合位點(diǎn)預(yù)測(cè)分子動(dòng)力學(xué)模擬最后一幀構(gòu)象進(jìn)行結(jié)合模式分析。ACE 蛋白的結(jié)合旋（α-Helix）和 β-折疊（β-sheet）狹長(zhǎng)的兩端開(kāi)口的管狀結(jié)構(gòu)。TQTMK 呈直線型結(jié)合在 ACE 的口袋，C 端氨基酸殘基暴露在袋LIVTQTMK 與 ACE 口袋內(nèi)的氨基酸殘基形成多種類型的相互作用MK 的 Leu1 和 Lys8 的質(zhì)子化 N 原子分別與 ACE 的 Asp77 和 Asp2作用，Met7 的羧基和 Gln5 的骨架氧原子分別與 Arg124 和 Arg415用；Gln5 與 Tyr231 和 Trp235，Thr6 與 Thr131 以及 Met7 與 Asn4氫鍵（氫鍵長(zhǎng)度為 2.8~3.5 ）。這些極性作用為 LIVTQTMK 的結(jié)電力貢獻(xiàn)。Leu1、Ile2 和 Gln5 支鏈上的非極性結(jié)構(gòu)部位與周圍8、Trp369、Leu149 和 Trp235）形成疏水作用，為其結(jié)合提供了廣
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