隨著產(chǎn)腸毒素大腸桿菌引起的食物中毒數(shù)量的增加,以及耐藥性細菌的大量出現(xiàn),研發(fā)新型的、安全的防腐劑是國內外研究的熱點問題。產(chǎn)腸毒素大腸桿菌耐熱腸毒素(st)和不耐熱腸毒素(lt)是主要的致病因子。含硫化合物具有抗癌、抗腫瘤、抗微生物的作用而被廣泛關注。本文選取異硫氰酸芐酯(BITC)、二烯丙基二硫醚(DADS)和異硫氰酸苯乙酯(PEITC)三種外源化合物,探究其對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌抑菌活性影響,通過RT-PCR方法,探究亞抑制濃度下異硫氰酸芐酯、二烯丙基二硫醚和異硫氰酸苯乙酯對毒力因子表達、信號分子AI-2相對活性以及群體感應基因表達的影響。為了探究異硫氰酸芐酯、二烯丙基二硫醚和異硫氰酸苯乙酯對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌致病機理的影響,根據(jù)ATP試劑盒測定其對菌體細胞總ATP和胞外ATP的影響,通過掃描電鏡觀察對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌體形態(tài)影響。結果表明:異硫氰酸芐酯、二烯丙基二硫醚和異硫氰酸苯乙酯最小抑菌濃度分別為160μmol/L,2mmol/L和400μmol/L。異硫氰酸芐酯、二烯丙基二硫醚和異硫氰酸苯乙酯均能下調毒力因子的表達,且呈一定的濃度依賴性。此外,異硫氰酸芐酯和二烯丙基二硫醚可以抑制產(chǎn)腸毒素大桿菌信號分子AI-2相對活性的表達,且呈一定的濃度依賴性。異硫氰酸芐酯和二烯丙基二硫醚可以下調群體感應基因LuxS和SdiA的表達。細胞總ATP含量降低,細胞外ATP的含量增加。通過掃描電鏡觀察異硫氰酸芐酯和異硫氰酸苯乙酯可以引起細胞表面皺縮,塌陷,甚至發(fā)生破裂,導致細胞內容物外泄。含硫化合物不僅能抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌毒力基因,信號分子和群體感應基因表達,而且對菌體的形態(tài)學也會產(chǎn)生影響。說明含硫化合物具有作為新型的食品防腐劑抑制產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的潛在應用價值。
【學位單位】：大連工業(yè)大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TS264.3
【文章目錄】：
摘要
abstract
第一章 緒論
    1.1 含硫化合物
        1.1.1 含硫化合物的發(fā)展趨勢
        1.1.2 含硫化合物來源
        1.1.3 含硫化合物結構特點
        1.1.4 含硫化合物主要種類
            1.1.4.1 異硫氰酸芐酯（BITC）
            1.1.4.2 二烯丙基二硫醚（DADS）
            1.1.4.3 異硫氰酸苯乙酯（PEITC）
    1.2 產(chǎn)腸毒素大腸桿菌（ENTEROTOXIGENICESCHERICHIACOLIETEC）概述
        1.2.1 生物學特性
        1.2.2 致病機理
            1.2.2.1 不耐熱腸毒素（heat-labileenterotoxin,LT）
            1.2.2.2 耐熱腸毒素（Heat-stableenterotoxin,ST）
            1.2.2.3 定值因子
            1.2.2.4 鞭毛
        1.2.3 外源物質對致病性產(chǎn)腸毒素大腸桿菌的抑制作用
            1.2.3.1 海洋微生物溶菌酶
            1.2.3.2 乳酸鏈球菌素
            1.2.3.3 二氫楊梅素
            1.2.3.4 中草藥
    1.3 群體感應概述
        1.3.1 LuxS/AI-2型感應系統(tǒng)
        1.3.2 SdiA
    1.4 研究的目的及意義
第二章 含硫化合物的抑菌活性研究
    2.1 實驗材料與儀器
        2.1.1 實驗菌株
        2.1.2 實驗樣品
        2.1.3 培養(yǎng)基
        2.1.4 試劑及藥品
        2.1.5 儀器設備
    2.2 實驗方法
        2.2.1 供試菌的活化
        2.2.2 樣品處理
        2.2.3 最小抑菌濃度（MIC）的測定
        2.2.4 生長曲線的測定
    2.3 結果與討論
        2.3.1 BITC對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌最小抑制濃度測定結果
        2.3.2 PEITC對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌最低抑制濃度測定結果
        2.3.3 DADS對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌最小抑制濃度測定結果
        2.3.4 BITC對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌生長的影響
        2.3.5 PEITC對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌生長曲線的影響
        2.3.6 DADS對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌生長的影響
        2.3.7 討論
    2.4 本章小結
第三章 含硫化合物對菌體毒力基因表達的影響
    3.1 實驗材料與儀器
        3.1.1 實驗菌株
        3.1.2 實驗樣品
        3.1.3 培養(yǎng)基的配置
        3.1.4 實驗試劑與藥品
        3.1.5 儀器設備
    3.2 實驗方法
        3.2.1 菌株活化
        3.2.2 樣品制備
        3.2.3 細菌總RNA提取與檢測
        3.2.4 除雜與cDNA合成
        3.2.5 實時熒光定量PCR
            3.2.5.1 引物特異性驗證
            3.2.5.2 含硫化合物對ETEC的毒力基因（st、lt）表達的影響
        3.2.6 統(tǒng)計分析
    3.3 結果與討論
        3.3.1 RNA的提取與檢測
        3.3.2 引物特異性檢測
        3.3.3 含硫化合物對ETEC毒力基因表達的影響
            3.3.3.1 BITC對耐熱毒素和不耐熱毒素表達的影響
            3.3.3.2 DADS對耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素表達的影響
            3.3.3.3 PEITC對耐熱腸毒素和不耐熱腸毒素表達的影響
        3.3.4 討論
    3.4 本章小結
第四章 含硫化合物對菌體群體感應基因表達的影響
    4.1 實驗材料與儀器
        4.1.1 實驗菌株
        4.1.2 實驗樣品
        4.1.3 培養(yǎng)基的配置
        4.1.4 實驗試劑與藥品
        4.1.5 儀器設備
    4.2 實驗方法
        4.2.1 菌株活化
        4.2.2 樣品制備
        4.2.3 含硫化合物對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌群體感應信號分子的影響
        4.2.4 含硫化合物對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌群體感應基因表達的影響
        4.2.5 統(tǒng)計分析
    4.3 結果與討論
        4.3.1 含硫化合物對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌信號分子表達的影響
            4.3.1.1 BITC對信號分子AI-2相對活性表達的影響
            4.3.1.2 DADS對信號分子AI-2相對活性表達的影響
        4.3.2 含硫化合物對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌群體感應基因的影響
            4.3.2.1 BITC對LuxS和SdiA表達的影響
            4.3.2.2 DADS對LuxS和SdiA表達的影響
        4.3.3 討論
    4.4 本章小結
第五章 含硫化合物對菌體生物特性的影響
    5.1 實驗材料與儀器
        5.1.1 實驗菌株
        5.1.2 實驗樣品
        5.1.3 試劑與藥品
    5.2 實驗方法
        5.2.1 菌株活化
        5.2.2 樣品處理
        5.2.3 總ATP和胞外ATP的測定
            5.2.3.1 總ATP的測定
            5.2.3.2 胞外ATP測定
        5.2.4 掃描電鏡（SEM）
        5.2.5 統(tǒng)計分析
    5.3 結果與討論
        5.3.1 總ATP和胞外ATP測定
        5.3.2 含硫化合物對產(chǎn)腸毒素大腸桿菌菌體形態(tài)的影響
        5.3.3 討論
    5.4 本章小結
第六章 結論與展望
    結論
    展望
參考文獻
致謝

【參考文獻】

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本文編號：2866793