D-乳酸(D-LA)作為L-乳酸的同分異構(gòu)體,是一種具有高附加值的平臺化合物。它可作為手性藥物、農(nóng)藥、及其他大宗化學(xué)品的中間體,也是可降解塑料聚乳酸(PLA)的合成單體。微生物法生產(chǎn)D-LA可以避免化學(xué)法帶來的環(huán)境污染。釀酒酵母作為一種安全性高的單細(xì)胞低等真核生物,具有耐酸性強(qiáng)、易于進(jìn)行基因編輯等優(yōu)點(diǎn),很適合于生產(chǎn)D-LA。但是,外源基因在釀酒酵母中存在表達(dá)差異性,重組菌株生長變慢,酸性物質(zhì)的積累對細(xì)胞毒害等問題,嚴(yán)重制約了D-LA在釀酒酵母中的生產(chǎn)。本文用代謝工程的方法從D-乳酸脫氫酶(D-LDH)的表達(dá)優(yōu)化,耐酸性的增強(qiáng),菌株生長速率的提高等方面構(gòu)建D-LA高產(chǎn)菌株。首先,以敲除丙酮酸脫羧酶基因的TAMH菌株為宿主菌,組合表達(dá)優(yōu)化篩選D-LA生產(chǎn)菌株。針對4個(gè)啟動(dòng)子,5個(gè)D-LDH,以及2個(gè)終止子的組合表達(dá)研究表明,在構(gòu)建的40個(gè)菌株中,含PTEF1-E.coli D-LDH-Tsynth25 表達(dá)載體的菌株TCSt,D-LA產(chǎn)量最高,達(dá)到5.8 g/L,光學(xué)純度達(dá)到了99.9%。為了提高D-LA的產(chǎn)量,將該基因表達(dá)簇插入到敲除Pdcl和Pdc6基因的YIP-01菌株的Ty1多拷貝位點(diǎn),利用雙酶偶聯(lián)方法篩選高產(chǎn)D-LA的整合菌株。基因組重測序結(jié)果表明,得到的整合菌株YIP-pTCSt-301含有3個(gè)D-LDH拷貝。在分批補(bǔ)料條件下發(fā)酵,該菌株產(chǎn)生了35 g/L D-LA,得率為0.45 g/g,產(chǎn)率為0.9 g/L/h。為了進(jìn)一步提高D-LA產(chǎn)量和得率,敲除了消耗D-LA的相關(guān)基因Dldl和Cyb2,轉(zhuǎn)運(yùn)D-LA到胞內(nèi)的相關(guān)基因Jen1,以及產(chǎn)乙醇的相關(guān)基因Adh1。得到的YIP-JCDA1菌株在分批補(bǔ)料條件下發(fā)酵,產(chǎn)生了80 g/L D-LA,得率提高到0.6 g/g,產(chǎn)率為1.1 g/L/h。其次,在YIP-JCDA1菌株的基礎(chǔ)上表達(dá)了Issatchenkia orientalis的IoGasl基因,其編碼蛋白具有耐受低pH和高鹽特性。得到的YIP-IJCDA1菌株在分批補(bǔ)料條件下發(fā)酵,D-LA達(dá)到了85.3 g/L,得率提高到0.71 g/g,產(chǎn)率提高到1.20 g/L/h。在此基礎(chǔ)上,繼續(xù)敲除甘油合成途徑的Gpd1和Gpd2基因和乙醇合成途徑的相關(guān)基因Adh5。得到的YIP-A15G12菌株,其D-LA產(chǎn)量達(dá)到92.0 g/L,得率為0.70 g/g,產(chǎn)率為1.21 g/L/h。D-LA光學(xué)純度為99.7%。再次,在YIP-IJCDA1菌株中過表達(dá)耐乙酸的Acs2基因和Haal基因,以及消耗胞質(zhì)內(nèi)乙醛的Ald6基因,得到的菌株的D-LA產(chǎn)量卻沒有顯著提高。在含IoGasl基因的YIP-IJCDA1菌株中過表達(dá)耐受乙酸的Whi2基因,菌株的葡萄糖發(fā)酵能力顯著增強(qiáng)。這表明Whi2基因能與IoGasl基因共同作用增強(qiáng)菌株在高濃度乙酸壓力下的葡萄糖發(fā)酵能力。最后,為了增加胞質(zhì)乙酰輔酶A的水平,在YIP-A15G12菌株中,表達(dá)了大腸桿菌的乙酰化乙醛脫氫酶(A-ALD)基因。A-ALD基因(mhpF和eutE)的表達(dá)提高了釀酒酵母胞內(nèi)的乙酰輔酶A水平,提高了菌株的生長速率。含有mhpF基因的YIP-m-ald6菌株,產(chǎn)D-LA的能力顯著提高。分批補(bǔ)料發(fā)酵55h,產(chǎn)率從1.21 g/L/h增加到1.68 g/L/h,D-LA產(chǎn)量達(dá)到了92.6 g/L,得率為0.70 g/g。D-LA光學(xué)純度達(dá)到了99.8%。
【學(xué)位單位】：中國科學(xué)院大學(xué)(中國科學(xué)院過程工程研究所)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ921.3
【部分圖文】：

?第１章引言???第１章引言??１．１?Ｄ－乳酸的生產(chǎn)方法??１．１．１?Ｄ－乳酸的性質(zhì)??乳酸分子式為Ｃ３Ｈ（，０３，又名２－羥基丙酸，ｅｘ－羥基丙酸，或者丙醇酸，分子??量為９０，熔點(diǎn)為１８．７?°Ｃ，在２５°Ｃ時(shí)密度為１．０５７?ｇ／ｍＬ。乳酸有一個(gè)手性中心，??有Ｄ－（－）乳酸（Ｄ－ＬＡ）和Ｌ－（＋）乳酸（Ｌ－ＬＡ）兩個(gè)對映異構(gòu)體，其結(jié)構(gòu)式如圖１．１。??乳酸溶于水、乙醇，有刺激性。乳酸的解離常數(shù)（ｐＫａ）在３．７９－３．８６之間［１］。??

?＂?—？??一－、ｗ??＾＇?ＴＡＴＡ?；＼ＡＴＧ??圖１．５啟動(dòng)子結(jié)構(gòu)示意圖１４２１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．５?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｐｒｏｍｏｔｅｒ１４２１．??啟動(dòng)子在基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控環(huán)節(jié)起著非常重要的作用，啟動(dòng)子的調(diào)控效率??會(huì)直接影響基因的表達(dá)效率。啟動(dòng)子是位于結(jié)構(gòu)基因５＇端上游的一段非編碼??ＤＮＡ序列。它通過活化ＲＮＡ聚合酶，使之與模板ＤＮＡ準(zhǔn)確結(jié)合，啟動(dòng)轉(zhuǎn)錄功??能。真核生物的啟動(dòng)子主要由轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)（ＴＦＢＳ），和非翻譯區(qū)（ＵＴＲ）??組成。轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)的ＤＮＡ序列較短，它對啟動(dòng)子調(diào)節(jié)功能有至關(guān)重要的??作用，這段ＤＮＡ序列稱為核心區(qū)。非翻譯區(qū)序列的長短也會(huì)影響轉(zhuǎn)錄的效果，??１２??

距離達(dá)到１０?ｂｐ就可以保障終止子的功能行使。效率元件的作用是增強(qiáng)下游位置??元件的效率，Ｔ富集區(qū)的作用是調(diào)控ｍＲＮＡ的穩(wěn)定性和ｍＲＮＡ的半衰期［４９］。這??種終止子的結(jié)構(gòu)示意圖如圖１．６所示。??３?—〇嚴(yán)??Ｔ，，，詹???５?－?ＴＡＧ?ＴＡＴＡＴＡ?ＡＡＷＡＡＡ?Ｔｒｋｈ?Ｙ（Ａ）？?Ｔｒｉｃｈ?－?３，??ＥＨＩｃｉｅｎｃｙ?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?Ｐｏｌｙ?Ａ）??ｂ?令，?Ｔ＿〇ｒ??５—?ＴＡＧ?ＴＡＴＡＴＡ?ＡＣＴＧＴＣＴＡＧＡ?ＡＡＴＡＡＡ?ＧＡＧＴＡＴＣＡＴＣ?ＴＴＴＣＡＡＡ?－?－ｖ??Ｃ??Ｔｅｍｙｎａｔｏｒ?＾??５－ｉ?ＴＡＧ?｜｜?＊?（ＴＡ）ｎ?＊?ＡＡＷＡＡＡ?＊?Ｙ（Ａ）ｎ?＊?＿?ｒ??Ｕｐｓｔｒｅａｍ?Ｅｆｆｉｃｉｅｎｃｙ?Ｌｉｎｋｌ?Ｐｏｓｉｔｉｏｎｉｎｇ?Ｌｉｎｋ２?Ｐｏｌｙ（Ａ）?Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ??圖１．６終止子結(jié)構(gòu)示意圖１４９１??Ｆｉｇｕｒｅ?１．６?Ｔｈｅ?ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ?ｏｆ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ１４９１，?（ａ）?Ｇｅｎｅｒａｌ?ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ａ?ｙｅａｓｔ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ，?（ｂ）??Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ?ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ?ｂｙ?ａｄｄｉｎｇ?Ｌｉｎｋ?ｅｌｅｍｅｎｔｓ，?（ｃ）?Ｄｉａｇｒａｍ?ｏｆ?ｓｙｎｔｈｅｔｉｃ??ｔｅｒｍｉｎａｔｏｒ?ｂｙ?ａｄｄｉｎｇ?Ｌｉｎｋ?１，?Ｌｉｎｋ２，?Ｕｐｓｔｒｅａｍ，?ａｎｄ?Ｄｏｗｎｓｔｒｅａｍ?ｅｌｅｍｅｎｔｓ．??常見的酵母天然終止子有Ｔｃｔｃ／
【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 陳國強(qiáng);王穎;;中國“生物基材料”研究和產(chǎn)業(yè)化進(jìn)展[J];生物工程學(xué)報(bào);2015年06期

2 甄光明;;乳酸及聚乳酸的工業(yè)發(fā)展及市場前景[J];生物產(chǎn)業(yè)技術(shù);2015年01期

本文編號：2865261