脂肪酶是一類重要的工業(yè)水解酶,已被廣泛應(yīng)用于食品工業(yè)、生物柴油、洗滌工業(yè)、生物制藥等領(lǐng)域。米根霉脂肪酶(Rhizopus oryzae lipase,ROL)是一種典型的脂肪酶,目前已商業(yè)化,常被用于高效制備結(jié)構(gòu)脂質(zhì)、生物柴油以及手性化合物。但和大多數(shù)酶一樣,ROL表現(xiàn)出熱不穩(wěn)定性。為提高ROL的熱穩(wěn)定性,拓寬其應(yīng)用范圍,本文利用發(fā)酵的粗酶液來研究ROL的熱失活規(guī)律和酶的穩(wěn)定劑,主要研究?jī)?nèi)容及結(jié)果摘要如下:1.將粗酶液ROL置于30-80℃的水浴中孵育以熱失活。結(jié)果表明,在30-50℃環(huán)境下處理3小時(shí),保持相對(duì)酶活力95%以上,基本不失活;當(dāng)溫度升高至60℃,處理3小時(shí),相對(duì)酶活力僅剩約29.50%,酶已有較大程度的失活;而當(dāng)溫度升至70℃和80℃后,水浴3分鐘,殘余相對(duì)酶活力分別為21.76%和9.26%,說明絕大部分酶失活。對(duì)較高溫度下熱失活規(guī)律進(jìn)一步探究發(fā)現(xiàn),上清中的相對(duì)酶活力和相對(duì)蛋白含量具有一致性,且ROL的熱失活過程符合兩步失活模型,即在活性態(tài)和非活性態(tài)之間還存在一個(gè)部分失活態(tài)。2.對(duì)實(shí)驗(yàn)室發(fā)酵的ROL進(jìn)行一系列分離純化,得到純度較高的ROL,純化倍數(shù)為1.62,回收率為10.83%。將純化后的ROL和未純化的ROL在不同溫度下進(jìn)行處理,發(fā)現(xiàn)未純化的ROL的穩(wěn)定性表現(xiàn)較好。采用圓二色譜法、內(nèi)源熒光光譜法以及外源熒光光譜法檢測(cè)純化ROL的結(jié)構(gòu)變化,發(fā)現(xiàn),隨著溫度的升高,表征其二級(jí)結(jié)構(gòu)的負(fù)槽消失,說明酶分子的二級(jí)結(jié)構(gòu)受到破壞;且內(nèi)源熒光光強(qiáng)增加,表明包埋在酶分子內(nèi)部的芳香族氨基酸殘基隨著結(jié)構(gòu)的打開而逐漸暴露在外;外源熒光光強(qiáng)增加,亦說明疏水性基團(tuán)也逐漸暴露出來。所有結(jié)果均說明,在ROL失活過程中隨著溫度的上升,二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)都會(huì)被逐漸破壞,導(dǎo)致酶逐漸失活。3.通過對(duì)各因素的篩選以及單因素優(yōu)化實(shí)驗(yàn),確定葡萄糖、山梨醇、NaCl、MgCl_2、聚氧乙烯吡咯烷酮-30(PVP-30)作為ROL熱穩(wěn)定劑復(fù)配原料。通過PB實(shí)驗(yàn)確定顯著因子為葡萄糖、山梨醇、NaCl,再通過爬坡試驗(yàn)逼近最佳濃度,最后通過響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)得出最佳復(fù)配比例為:葡萄糖濃度35.94%(m/v)、山梨醇濃度34.82%(m/v)、NaCl濃度2.50 mol/L,此條件下相對(duì)酶活力預(yù)測(cè)值為97.715%,與實(shí)際值高度擬合。
【學(xué)位單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ426.97
【部分圖文】：

華 中 科 技 大 學(xué) 碩 士 學(xué) 位 論 分析離純化結(jié)果 可知，當(dāng)飽和度低于 50%時(shí)，沉淀法的效果并不明顯，沉和度達(dá)到 60%時(shí)，ROL 沉淀開始較多析出，當(dāng)飽和度達(dá) 1/2）時(shí)沉淀法效果最好，能較多析出目標(biāo)蛋白，但是雜。由于更高飽和度的硫酸銨可能會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)的失活，擇 80%飽和度的硫酸銨進(jìn)行鹽析。

圖 3.2 ROL 等電點(diǎn)和分子量的在線計(jì)算Fig.3.2 Online calculation of ROL isoelectric point and molecular weight純化的各項(xiàng)參數(shù)如表 3.2 所示，由結(jié)果可知，在對(duì) ROL 進(jìn)行分離白和總酶活力是逐漸減小的，這說明在分離純化的過程中 ROL 是硫酸銨沉淀，酶活回收率為 59.82%，說明溶液中的蛋白質(zhì)較多的為 1.14，說明 ROL 純度并沒有有效的提升。透析后回收率和純化相差不大。離子交換層析后，純化倍數(shù)為 1.61。而疏水層析法的，較離子交換層析法而言并沒有多大的提高。對(duì) ROL 粗酶液進(jìn)行后操作后，最終回收率只有 10.83%，純化倍數(shù)為 1.62。相較于常數(shù)而言，本次實(shí)驗(yàn)的純化倍數(shù)較低，這是因?yàn)?ROL 在畢赤酵母中高，其他雜蛋白含量較少，通過蛋白膠我們也可以看到經(jīng)過純化明顯的提升，雜蛋白很少。

ROL 的分離與純化。A：硫酸銨沉淀法。M：蛋白 marker;1：粗酶液；2：酶液；B：離子交換層析法。M：蛋白 marker;1：粗酶液；2：離子交換層：疏水層析法。M：蛋白 marker;1：粗酶液；2：疏水層析法純化后的酶.3.3 Isolation and purification of ROL.A：Ammonium sulfate precipitation；ane1:Crude enzyme solution；Lane2：Enzyme solution purified by ammoni；B：Ion exchange chromatography；M:maker；Lane1:Crude enzyme solulution purified by ammonium sulfate precipitation；C：Hydrophobic chrom；Lane1:Crude enzyme solution；Lane2：Enzymatic solution purified by hychromatography.溫度下 ROL 活性變化結(jié)果 在不同溫度下處理 1 h 后酶活力的變化結(jié)果如圖 3.4。由結(jié)果可化的 ROL 在低溫條件下較為穩(wěn)定，30℃和 40℃下水浴 1 h，
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本文編號(hào)：2863972