白藜蘆醇是一種天然多酚,具有顯著的抗氧化活性,在預防癌癥、保護心血管和神經(jīng)系統(tǒng)、提高免疫、延長壽命等方面有重要作用,目前其在食品、醫(yī)藥、膳食補充劑、保健品和化妝品領(lǐng)域中有重要的應(yīng)用價值。由于白藜蘆醇生物利用度非常低,且在體內(nèi)的代謝和排泄能力較強,把白藜蘆醇和羧酸酯化,可有助于增加白藜蘆醇的親脂性、細胞穿透性和生物利用度,且兩者之間還具有協(xié)同效應(yīng)。本研究篩選一株能高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase,BGL,EC 3.2.1.21)的菌株,利用該酶高效水解虎杖苷得到白藜蘆醇,以白藜蘆醇和有機酸為原料合成多種白藜蘆醇酯。通過對實驗室保藏的14株具有產(chǎn)β-葡萄糖苷酶潛力的不同真菌(其中有4株未鑒定)的產(chǎn)酶能力分析,確定產(chǎn)酶能力最高的菌株Aspergillus niger SK34.002,其所產(chǎn)胞外BGL酶活力可達6.68 U/mL。其ITS序列全長561 bp,已提交至NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫,獲得數(shù)據(jù)庫登記號為MH032751。BGL的合成比菌體生長滯后,第3天開始產(chǎn)酶,最大產(chǎn)酶期在8天左右,將所產(chǎn)酶液作用于虎杖粉,對虎杖苷水解效果顯著,且該菌具有很好的遺傳穩(wěn)定性。收集A.niger SK34.002的發(fā)酵液作為粗酶液,經(jīng)活性炭脫色、硫酸銨分級沉淀、HiTrap Q HP離子交換層析和Superdex 200 10/300 GL凝膠過濾層析等步驟,獲得純化的BGL,比酶活為76.4 U/mg,純化倍數(shù)達45倍。對酶的純度和分子量進行測定,結(jié)果表明BGL是單亞基酶,分子量為128 kDa。通過對BGL的酶學性質(zhì)研究發(fā)現(xiàn),該酶的最適反應(yīng)pH為4.5,pH超過7.0以后基本喪失酶活;在pH 3.0~4.5的檸檬酸緩沖液中保持24 h后,酶活仍可保持90%以上。該酶在60~70℃之間表現(xiàn)出較高的酶活力,其最適反應(yīng)溫度為70℃,但在該溫度下不穩(wěn)定;55℃以下保持高度的穩(wěn)定性,該酶儲藏穩(wěn)定性非常好,在工業(yè)化生產(chǎn)中有明顯優(yōu)勢。常見金屬離子及EDTA對酶活基本沒有影響,說明BGL為非金屬依賴性酶。對該酶的底物特異性研究發(fā)現(xiàn),該酶對所選的11種底物都能發(fā)生水解,其中活性最好的前三個底物分別是纖維二糖(209.9 U/mgprotein)、4-硝基苯基-β-D-吡喃葡萄糖苷(pNPG,173.1U/mgprotein)和虎杖苷(75.9 U/mgprotein)。該酶對以上三個底物發(fā)生水解反應(yīng)的米氏常數(shù)K_m分別為8.9 mM、2.9 mM和0.74 mM,可見,BGL對虎杖苷具有相對較低的K_m值,說明該酶對虎杖苷有更好的親和力。同時研究了葡萄糖對BGL的抑制性,結(jié)果顯示葡萄糖對BGL在pNPG為底物時表現(xiàn)為競爭性抑制,抑制常數(shù)K_i為3.8 mM。純酶經(jīng)SDS-PAGE蛋白電泳分析,切膠處理后采用MALDI-TOF/TOF-MS分析肽譜和各肽段的氨基酸信息,經(jīng)檢索獲得一個Mascot Score達到173的有效匹配,匹配蛋白為beta-glucosidase[Aspergillus niger],氨基酸覆蓋率5%,判斷BGL為β-葡萄糖苷酶,但從有效的匹配肽段僅有兩段推測該蛋白是一種新蛋白。以該酶對虎杖粉中的虎杖苷進行酶解,通過單因素實驗得出酶解的最優(yōu)工藝條件為:β-葡萄糖苷酶用量2.7 U/(g虎杖),pH=4.5,60℃酶解2.5 h,在該條件下,虎杖苷的轉(zhuǎn)化率達到98%以上,白藜蘆醇的含量比未酶解前提高了6.2倍。以21%(w/w)乙醇/22%(w/w)硫酸銨雙水相體系為萃取劑,利用超聲輔助雙水相萃取技術(shù)直接從虎杖酶解液中提取白藜蘆醇。利用聚酰胺柱層析進行分離純化,干燥后得純度為80.8%的白藜蘆醇,總收率73.6%。以白藜蘆醇和有機酸為起始原料,經(jīng)兩步法合成了6個白藜蘆醇酯:三乙酰水楊酸白藜蘆醇酯、三肉桂酸白藜蘆醇酯、亞麻酸-3-白藜蘆醇酯、亞麻酸-4'-白藜蘆醇酯、三花生四烯酸白藜蘆醇酯和三DHA白藜蘆醇酯。所合成的化合物通過質(zhì)譜、紅外、氫譜、碳譜等檢測手段確認結(jié)構(gòu)。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ28
【部分圖文】：

圖 1-4 β-葡萄糖苷酶雙取代“兩步法”構(gòu)型保持機理[99]Fig.1-4 A two step double-displacement retaining mechanism for β-glucosidase

圖 1-5 研究思路圖Fig. 1-5 The flow chart of experimental methods具體研究內(nèi)容如下：1. β-葡萄糖苷酶產(chǎn)生菌株的篩選和鑒定。篩選獲得 β-葡萄糖苷酶高產(chǎn)菌株，菌株進行鑒定；

圖 2-1 pNP 標準曲線Fig.2-1 Standard curve of pNP定工作液的配制：準確稱取 150.6 mg pNPG，溶解于 100 )中，得 5 mM pNPG 底物工作液，備用。
【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前8條

1 劉震;朱秋享;石賢愛;彭永輝;陳蔭楠;;β-葡萄糖苷酶體外分子改造研究進展[J];福州大學學報(自然科學版);2015年04期

2 劉學珍;林軍;劉向磊;胡海峰;朱寶泉;;白藜蘆醇的藥理作用及其微生物合成的研究進展[J];世界臨床藥物;2015年01期

3 楊陽;李傳剛;舒曉宏;;白藜蘆醇代謝模式的研究進展[J];中國藥學雜志;2013年24期

4 張煜梅;黃健花;金青哲;王興國;;反式及順式白藜蘆醇光穩(wěn)定性分析[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2013年11期

5 董學偉;余慧琳;陳莉;張春枝;;酶轉(zhuǎn)化虎杖苷制備白藜蘆醇[J];食品與發(fā)酵工業(yè);2008年12期

6 潘利華;羅建平;;β-葡萄糖苷酶的研究及應(yīng)用進展[J];食品科學;2006年12期

7 李夢青;耿艷輝;劉桂敏;張晴;康彥芳;;雙水相萃取技術(shù)在白藜蘆醇提純工藝中的應(yīng)用[J];天然產(chǎn)物研究與開發(fā);2006年04期

8 李遠華;β-葡萄糖苷酶的研究進展(綜述)[J];安徽農(nóng)業(yè)大學學報;2002年04期

本文編號：2863212