多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素因其在食品和醫(yī)藥領(lǐng)域的廣泛作用而得到人們極大的關(guān)注,當(dāng)前利用微生物發(fā)酵生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素具有諸多優(yōu)點(diǎn),由于酵母生產(chǎn)迅速且生物量較高,利用酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素已成為人們關(guān)注的熱點(diǎn),以代謝工程方法改造酵母生產(chǎn)多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素也具有良好前景。我們前期研究表明,病毒STSV2編碼的ORF2蛋白在感染宿主過程中能顯著上調(diào)病毒和宿主基因的轉(zhuǎn)錄水平,可能是一個(gè)潛在的轉(zhuǎn)錄激活因子。此外,產(chǎn)油酵母—紅冬孢酵母(Rhodosporidium kratochvilovae)YM25235菌株同時(shí)產(chǎn)多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素,因此本研究擬將ORF2基因轉(zhuǎn)化YM25235菌株中進(jìn)行表達(dá),分析其對YM25235菌株生長以及多不飽和脂肪酸和類胡蘿卜素合成的影響。將ORF2基因插入表達(dá)載體pRH2304,構(gòu)建重組表達(dá)質(zhì)粒pRH2034ORF2,利用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化法將其轉(zhuǎn)化至紅冬孢酵母YM25235中,然后分析ORF2基因表達(dá)對YM25235菌株環(huán)境脅迫抗性的影響。結(jié)果顯示,ORF2基因表達(dá)提高了YM25235菌株的高鹽脅迫,高滲透壓脅迫和低溫脅迫的耐受性,同時(shí)也能促進(jìn)轉(zhuǎn)基因菌株中甘油合成量。進(jìn)一步脂肪酸分析結(jié)果表明,ORF2轉(zhuǎn)基因菌株中亞油酸(linoleic acid,LA)和亞麻酸(linoleinic acid,ALA)含量較野生型菌株從16.97%和3.42%增加到22.39%和5.88%,分別增加了1.32倍和1.72倍,而油酸(oleic acid,OA)的含量明顯減少。mRNA轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果還顯示,ORF2基因表達(dá)促進(jìn)了催化轉(zhuǎn)基因菌株中催化OA連續(xù)轉(zhuǎn)化為LA和ALA的Δ~(12/15)-脂肪酸脫氫酶基因RKD12的mRNA轉(zhuǎn)錄水平提高了1.89倍。進(jìn)一步的凝膠阻滯技術(shù)(EMSA)分析發(fā)現(xiàn),通過大腸桿菌BL21異源表達(dá)的ORF2蛋白可以與RKD12基因的啟動子RKD12P之間存在相互作用。這些結(jié)果表明在YM25235轉(zhuǎn)基因菌株中ORF2基因編碼產(chǎn)物結(jié)合RKD12基因的啟動子RKD12P,促進(jìn)RKD12基因的mRNA轉(zhuǎn)錄水平,從而增加了PUFAs的合成量,進(jìn)而提高了菌株的低溫適應(yīng)性。為了研究ORF2基因表達(dá)對紅冬孢酵母YM25235菌株油脂和類胡蘿卜素合成的影響,進(jìn)一步對ORF2轉(zhuǎn)化的YM25235菌株中油脂和類胡蘿卜素含量變化進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,與對照菌株相比,ORF2基因轉(zhuǎn)化的YM25235轉(zhuǎn)基因菌株中油脂含量為31.06 mg/g,較野生型菌株的20.3 mg/g提高了1.53倍,而且轉(zhuǎn)基因菌株中類胡蘿卜素含量為2.29 mg/g,較野生型菌株的類胡蘿卜素含量1.33mg/g提高了約1.72倍。mRNA轉(zhuǎn)錄水平分析結(jié)果也表明,ORF2基因表達(dá)能促進(jìn)了油脂和類胡蘿卜素合成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄,從而提高了轉(zhuǎn)基因菌株中油脂和類胡蘿卜素的合成。這些結(jié)果進(jìn)一步證表明,ORF2蛋白是一個(gè)普遍性的能促基因轉(zhuǎn)錄的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子。綜上所述,硫化葉菌病毒STSV2基因ORF2表達(dá)促進(jìn)了紅冬孢酵母YM25235菌株抗高鹽和高滲透壓脅迫以及低溫生長適應(yīng)性,還顯著提高了YM25235菌株中多不飽和脂肪酸、油脂和類胡蘿卜素的合成。本研究結(jié)果為紅冬孢酵母多不飽和脂肪酸、油脂和類胡蘿卜素的代謝工程化生產(chǎn)提供了理論依據(jù),同時(shí)也為進(jìn)一步分析ORF2蛋白的結(jié)構(gòu)和功能提供參考。
【學(xué)位單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1
【部分圖文】：

和延長酶途徑，只是其所含的去飽和酶或者延長酶種類和數(shù)量不同導(dǎo)致最終合成的脂肪酸成分的差異。在酵母菌中，脂肪酸從頭合成始于線粒體中形成檸檬酸，圖1.1 ω-3和ω-6脂肪酸去飽和鏈伸長的途徑Figure1.1 Pathways for desaturation chain elongation of omega-3 and omega-6fatty acids

檸檬酸裂解產(chǎn)生的乙酰-CoA 通過脂肪酸合成酶（fatty acid synthase，F(xiàn)AS）生成飽和脂肪酸，再通過連續(xù)延長和去飽和反應(yīng)生成多不飽和脂肪酸。圖1.2[9]總結(jié)了酵母中以葡萄糖為底物，酵母體內(nèi)不飽和脂肪酸合成途徑以及通過代謝工程手段在酵母體內(nèi)實(shí)現(xiàn)的PUFAS 生產(chǎn)，如花生四烯酸、二十碳五烯酸（eicosapentaenoic acid，EPA）和二十二碳六烯酸（docosahexaenoic acid，DHA）合成的路徑，其中所涉及的一系列脫氫酶、去飽和酶和延長酶已經(jīng)從眾多微生物中分離出來，這為對酵母菌進(jìn)行代謝工程改造生產(chǎn)PUFAs 提供了可能[10]。1.3 多不飽和脂肪酸的生物學(xué)功能1.3.1 對機(jī)體免疫功能的影響PUFAs的免疫調(diào)節(jié)功能已經(jīng)在人類醫(yī)學(xué)和動物試驗(yàn)中得到證明。飼糧中添加圖 1.2 酵母中脂肪酸合成途徑Figure 1.2 Fatty acid synthesis pathway in yeast

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文厚度，流動性或滲透性），這對于它們的正常運(yùn)作起關(guān)鍵作用。例如，穩(wěn)定性和一些其他膜相關(guān)過程，如信號轉(zhuǎn)導(dǎo)被改變[58-60]。隨后的變化也可能導(dǎo)致膜對 ROS的抗性的顯著增強(qiáng)，對人類健康具有積極影響，因?yàn)樵S多慢性疾病的分子機(jī)制似乎至少部分涉及 ROS 相互作用。
【參考文獻(xiàn)】

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