目前纖維素酶的成本過高是限制燃料乙醇工業(yè)化生產(chǎn)的主要因素之一,因而如何提高纖維素酶水解效率,降低纖維素酶用量是當前燃料乙醇生產(chǎn)領域的研究熱點。在木質(zhì)纖維原料中,半纖維素會覆蓋在纖維素表面形成物理屏障,降低纖維素酶對纖維素的可及性。為克服該屏障作用,原料中的半纖維素需要轉(zhuǎn)化為游離態(tài)或者是被水解為可溶性的糖。研究表明游離態(tài)的木聚糖(闊葉材和禾本科中半纖維素的主要成分)及其水解產(chǎn)物對纖維素水解有強烈的抑制作用,但是游離態(tài)的甘露聚糖(針葉材中半纖維素的主要成分)及其水解產(chǎn)物對纖維素水解效率的影響還尚不清楚。因而本文圍繞游離態(tài)的甘露聚糖及其水解產(chǎn)物對纖維素酶水解纖維素的影響開展系統(tǒng)研究,探究了甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的機制,并在深入了解其抑制機制的基礎上探究了緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的有效措施,以期為開發(fā)水解得率高、酶制劑使用量少的高效酶水解技術(shù)提供理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容和結(jié)果如下:首先考察了不同種類的甘露聚糖(直鏈甘露聚糖、低分子量半乳甘露聚糖以及高分子量半乳甘露聚糖)對纖維素水解效率的影響,并探究了甘露聚糖結(jié)構(gòu)特性包括分子量和半乳糖取代基等對甘露聚糖抑制纖維素水解的影響。研究結(jié)果顯示,這三種甘露聚糖均會抑制纖維素水解,在纖維素酶水解微晶纖維素Avicel的體系中分別添加2.5mg/mL直鏈甘露聚糖、高分子量半乳甘露聚糖以及低分子量半乳甘露聚糖后,Avicel酶解得率降低了13.75%-39.10%。甘露聚糖對纖維素水解的抑制作用與甘露聚糖的結(jié)構(gòu)特性密切相關,高分子量的甘露聚糖對纖維素水解的抑制作用強于低分子量甘露聚糖的抑制作用,而半乳糖基支鏈的存在會使甘露聚糖對纖維素水解的抑制作用能力減弱。探究了甘露聚糖對單一纖維素酶組分(內(nèi)切葡聚糖酶Cel5A、外切葡聚糖酶Cel6A和Cel7A以及β-葡萄糖苷酶Cel3A)酶促反應動力學的影響,揭示了甘露聚糖抑制纖維素水解的機制。通過探究甘露聚糖對單一纖維素酶組分水解能力的影響,發(fā)現(xiàn)甘露聚糖對Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力有強烈的抑制作用,但是對Cel3A的水解能力沒有影響。動力學試驗結(jié)果表明甘露聚糖會占據(jù)Cel7A的活性位點,從而競爭性的抑制Cel7A的活力,其中高分子量半乳甘露聚糖對Cel7A活力的抑制作用最強(抑制常數(shù)K_i為0.43 mg/mL),低分子量半乳甘露聚糖的抑制作用次之(抑制常數(shù)K_i為0.47mg/mL),直鏈甘露聚糖的抑制作用最弱(抑制常數(shù)K_i為0.50 mg/mL)。研究了甘露聚糖水解產(chǎn)物(甘露低聚糖、甘露糖和半乳糖)對纖維素水解效率的影響。研究結(jié)果顯示,甘露低聚糖、甘露糖和半乳糖也會抑制纖維素水解效率,其中甘露低聚糖抑制纖維素水解的能力最強,其次是半乳糖,再次是甘露糖。在纖維素酶水解Avicel的體系中分別添加等量的(5 mg/mL)甘露低聚糖、半乳糖和甘露糖后,Avicel酶解得率分別降低了12.70%、4.23%和3.97%。進一步探究甘露低聚糖結(jié)構(gòu)特性包括鏈長和半乳糖取代基等對甘露低聚糖抑制纖維素水解的影響可知,甘露低聚糖對纖維素水解的抑制作用隨甘露低聚糖鏈長的增加而減弱,隨半乳糖取代基的移除而增強。通過探究甘露低聚糖、甘露糖及半乳糖對單一纖維素酶組分水解能力的影響,發(fā)現(xiàn)甘露低聚糖對Cel5A和Cel3A的水解能力沒有抑制作用,但是會抑制Cel6A和Cel7A的水解能力,而甘露糖和半乳糖對Cel5A、Cel6A和Cel7A的水解能力均有抑制作用。動力學試驗結(jié)果進一步表明甘露低聚糖是Cel7A的競爭性抑制劑(抑制常數(shù)K_i為1.57mg/mL)。探究了甘露聚糖酶對甘露聚糖抑制纖維素水解的緩解作用,并從緩解甘露聚糖抑制的角度揭示了甘露聚糖酶強化木質(zhì)纖維原料酶解的機制。研究結(jié)果顯示,甘露聚糖酶能有效的緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物對纖維素水解的抑制作用,在纖維素酶水解Avicel的體系中添加5 mg/mL半乳甘露聚糖后,Avicel的酶解得率從38.75%降低到了18.68%,進一步添加內(nèi)切甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶和半乳糖苷酶后,Avicel的酶解得率顯著提高到了35.33%。在纖維素酶水解白云杉纖維素的過程中,添加甘露聚糖酶后,白云杉纖維素的酶解得率提高了14.29%。進一步分析酶解液中纖維素酶活力的變化可知,添加甘露聚糖酶后,酶解液中Cel5A和Cel7A的活力分別提高了14.30%和10.91%,表明甘露聚糖酶可通過緩解酶解液中甘露聚糖對Cel5A和Cel7A活力的抑制作用,提高纖維素酶的活力,進而強化白云杉纖維素酶解。探究了化學助劑Tween 80對甘露聚糖及其水解產(chǎn)物抑制纖維素水解的緩解作用。研究結(jié)果顯示,Tween 80能在一定程度上緩解甘露聚糖、甘露低聚糖、甘露糖及半乳糖對纖維素水解的抑制作用,在纖維素酶水解Avicel的體系中分別添加半乳甘露聚糖(5 mg/mL)、甘露低聚糖(5 mg/mL)、甘露糖(10 mg/mL)和半乳糖(10 mg/mL)后,Avicel的酶解得率從48.60%分別降低到了26.64%、39.96%、39.15%和36.90%,進一步添加Tween 80后,Avicel的酶解得率分別提高到了36.00%、46.58%、46.35%和45.00%。動力學試驗結(jié)果表明Tween 80對Cel5A和Cel3A的活力沒有影響,但是對Cel7A的活力有激活作用,該激活作用可以有效的緩解甘露聚糖及其水解產(chǎn)物對Cel7A活力的抑制作用,從而提高酶水解過程中纖維素酶的活力,進而提高木質(zhì)纖維原料的酶解效率。
【學位單位】：西北農(nóng)林科技大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2019
【中圖分類】：TQ353
【部分圖文】：

為增加纖維素酶對纖維素底物的可及度，提高木質(zhì)纖維原料糖轉(zhuǎn)化效率，在對原料進行酶解之前需要用化學、物理或者生物等方法對其預處理 (Putro et al. and Huang 2014)。盡管預處理過程成本較高（平均成本為 20 美元/噸生物質(zhì)），理在提高木質(zhì)纖維原料后續(xù)酶水解效率、減少纖維素酶所需劑量從而降低纖成本中有極為重要的作用(Mosier et al. 2005b)。預處理提高木質(zhì)纖維原料水解用主要歸結(jié)于以下幾個方面：（1）移除半纖維素；（2）移除和再分配木質(zhì)素；（纖維素的聚合度和結(jié)晶度；（4）增加原料的孔隙度 (Chandra et al. 2007; Mansfi1999; Pan et al. 2005)。圖 1-1 為預處理對木質(zhì)纖維原料結(jié)構(gòu)影響的示意圖。經(jīng)發(fā)展，目前針對不同的原料已開發(fā)出了一系列不同的預處理方法，目前常見方法大致可分為物理法（例如球磨、碾磨、輻射）、化學法（例如堿、稀酸、有機溶劑等）、物理化學法（例如蒸汽預處理、水解預處理）和生物法，以及的結(jié)合 (Alvira et al. 2010; Sun et al. 2016)。不同預處理方法的優(yōu)缺點如表1-3所可知，常用的預處理方法均有其獨特的一面，同時均存在一定的缺陷，因而有可以適用于所有底物的，高效的預處理技術(shù)。故在選擇預處理技術(shù)時要充物組分和類型 (Mussatto and Dragone 2016)。

1.3.2.1 纖維素酶系統(tǒng)纖維素酶是水解木質(zhì)纖維原料的主要酶系。纖維素酶系統(tǒng)是由內(nèi)切葡聚糖酶（EC3.2.1.4）、外切葡聚糖酶（EC 3.2.1.91）和 β-葡萄糖苷酶（EC 3.2.1.21）組成 (Taha et al.2016; Watanabe et al. 2010)。如圖 1-2 所示，內(nèi)切葡聚糖酶隨機切割無定形區(qū)纖維素主鏈的 β-1，4 糖苷鍵，生成不同聚合度的、帶有非還原性末端或者還原性末端的寡糖，外切葡聚糖酶 Cel7A 作用于纖維素的還原性末端，Cel6A 作用于纖維素的非還原性末端將其水解為纖維二糖，然后 β-葡萄糖苷酶將纖維二糖進一步水解為葡萄糖 (Benoitet al. 2015; van den Brink and de Vries 2011)。單一組分的纖維素酶不能有效的水解纖維素，纖維素的高效水解需要這三種組分的協(xié)同作用 (Henrissat et al. 1985; Nidetzky et al.1994; Zhang and Lynd 2004)。在常見的里氏木霉屬纖維素酶系統(tǒng)中，外切葡聚糖酶Cel7A 的比重高達 60%左右，外切葡聚糖酶 Cel6A 的比重約為 15%，內(nèi)切葡聚糖酶的比重相對較低，約 10%左右 (McFarland et al. 2007b)。

第一章 文獻綜述1.3.2.2 半纖維素酶系統(tǒng)和纖維素相比，半纖維素的結(jié)構(gòu)更加復雜，因而水解半纖維素所需要的酶系也更加復雜。水解木聚糖所需的酶包括內(nèi)切 β-1,4-內(nèi)切木聚糖酶（EC 3.2.1.8）、α-L-阿拉伯糖苷酶（EC 3.2.1.55）、乙�；揪厶酋ッ福‥C 3.1.1.72）、α-D-葡糖醛酸酶（EC 3.2.1.139）、阿魏酸酯酶（EC 3.1.1.73）以及 β-木糖苷酶（EC 3.2.1.37）等 (Taha et al. 2016)。如圖 1-3 所示，內(nèi)切木聚糖酶切割木聚糖主鏈為寡糖，然后由 β-木糖苷酶將其水解為木糖。α-L-阿拉伯糖苷酶和 α-D-葡糖醛酸酶移除相應的阿拉伯糖取代基和 4-O-甲基葡萄糖醛酸取代基 (Iveti et al. 2017; Kumar and Murthy 2013; Saha 2003; Van Dyk andPletschke 2012)。乙酰酯酶作用于乙酰取代基，阿魏酸酯酶則水解阿拉伯糖取代基和阿魏酸之間的酯鍵，從而使得木聚糖和木質(zhì)素分離 (Mosier et al. 2005b)。
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本文編號：2858068