發(fā)布時(shí)間：2020-10-21 07:37

　　 食用蕈菌味道鮮美,營(yíng)養(yǎng)價(jià)值豐富,開發(fā)和利用野生食用蕈菌資源,對(duì)豐富野生食用蕈菌種質(zhì)資源庫(kù)意義重大,是蕈菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關(guān)鍵。本課題運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察結(jié)合內(nèi)轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal Transcribed Spacer,ITS)基因測(cè)序的方法對(duì)野外采集到的疑似野生馬鞍菌X1菌株進(jìn)行了分類鑒定;測(cè)定了該菌子實(shí)體的主要營(yíng)養(yǎng)成分;采用電感耦合等離子體原子發(fā)射光譜法(Inductively Coupled Plasma-Atomic Emission Spectrometry,ICP-AES)對(duì)其子實(shí)體礦物質(zhì)進(jìn)行了檢測(cè);采用氣相色譜-質(zhì)譜(Gas Chromatography-Mass Spectrometry,GC-MS)聯(lián)用技術(shù)對(duì)其子實(shí)體揮發(fā)性成分進(jìn)行了定性和定量分析;以DPPH·和ABTS~+·清除能力為指標(biāo),以BHT作為陽(yáng)性對(duì)照,測(cè)定了子實(shí)體粗多糖的體外抗氧化活性;對(duì)其子實(shí)體粗提物進(jìn)行了急性毒理試驗(yàn);在此基礎(chǔ)上,對(duì)其菌絲體的生物學(xué)特性進(jìn)行了探究,設(shè)計(jì)了人工栽培試驗(yàn);并采用Illumina Miseq高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)該菌子實(shí)體根際土壤真菌群落組成及多樣性進(jìn)行了分析;最后對(duì)其菌絲體進(jìn)行了液態(tài)和固態(tài)發(fā)酵研究。主要研究結(jié)果如下:(1)運(yùn)用形態(tài)學(xué)觀察與分子生物學(xué)技術(shù)相結(jié)合的方法,確定了X1菌株的分類地位。結(jié)果顯示:X1菌株隸屬子囊菌門(Ascomyzcota)盤菌綱(Pezizomycetes)盤菌目(Pezizales)馬鞍菌科(Helvellaceae)馬鞍菌屬(Helvella),拉丁文學(xué)名為Helvella lacunosa,中文名稱為棱柄馬鞍菌,異名多洼馬鞍菌。(2)對(duì)棱柄馬鞍菌子實(shí)體的主要營(yíng)養(yǎng)成分進(jìn)行了測(cè)定,結(jié)果表明:該菌子實(shí)體粗蛋白含量達(dá)23.72%,粗脂肪含量達(dá)3.65%,粗纖維含量達(dá)55.12%;子實(shí)體中共檢測(cè)到17種氨基酸,包括人體所必需的8種氨基酸,必需氨基酸含量是非必需氨基酸含量的0.64倍,且鮮味氨基酸(Asp、Glu、Gly和Ala)占氨基酸總量的30.07%;采用ICP-AES法對(duì)子實(shí)體的16種礦質(zhì)元素進(jìn)行了檢測(cè),結(jié)果表明:子實(shí)體含有豐富的礦質(zhì)元素,其中Fe、Zn、K、Na、Ca、Mn、Cu及Mg的含量分別為0.114μg/g、0.017μg/g、2.13μg/g、0.13μg/g、0.0046μg/g、0.0053μg/g、0.0032μg/g、0.1005μg/g,重金屬只檢出As和Sb,含量分別為0.0021μg/g和0.0013μg/g,均低于國(guó)家食品標(biāo)準(zhǔn)規(guī)定的0.1μg/g的限量要求;采用GC-MS法對(duì)子實(shí)體的揮發(fā)性成分進(jìn)行分析,共檢測(cè)到122種化合物,確定結(jié)構(gòu)39種,占總揮發(fā)性成分的81.5%,其中相對(duì)含量較高的己醛、己酸、乙酸和2-戊基呋喃是國(guó)家規(guī)定允許使用的食用香料,是調(diào)香原料不可缺少的物質(zhì);以DPPH·和ABTS~+·清除能力為指標(biāo),測(cè)定了子實(shí)體粗多糖的體外抗氧化活性,結(jié)果表明:該菌子實(shí)體粗多糖具有較強(qiáng)的抗氧化性,當(dāng)濃度為10mg/mL時(shí),對(duì)DPPH·和ABTS~+·的清除率分別達(dá)到49.18%和53.33%;由子實(shí)體粗提物急性毒理試驗(yàn)結(jié)果可知,用藥組最大給藥劑量達(dá)0.4mL/10g.bw時(shí),實(shí)驗(yàn)小鼠生存狀況良好,未出現(xiàn)明顯的致毒反應(yīng),且14d內(nèi)實(shí)驗(yàn)小鼠全部存活,處死解剖后的小鼠臟腑器官未見明顯的病理改變。根據(jù)食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn),可以認(rèn)定棱柄馬鞍菌是安全無毒的。由此可見,該野生菌不但營(yíng)養(yǎng)豐富,味道鮮美,且無毒性,是一種值得開發(fā)利用的蕈菌。(3)以PDA培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,利用平板培養(yǎng)的方法初步研究了X1菌株的生物學(xué)特性,研究結(jié)果表明:X1菌株菌絲體生長(zhǎng)的最佳碳源為葡萄糖、氮源為酵母浸膏、無機(jī)鹽為MgSO_4;最佳培養(yǎng)溫度為25℃,適宜pH為6.5,適宜光照條件為12h黑暗+12h光照。人工栽培X1菌株試驗(yàn)結(jié)果表明:X1菌株最適宜的原種培養(yǎng)基為松木屑+麩皮煮汁瓊脂培養(yǎng)基;最佳母種培養(yǎng)基為松木屑+麥粒培養(yǎng)基;最適宜的栽培料配方是松木屑+棉籽殼,X1菌絲體在該培養(yǎng)料上長(zhǎng)勢(shì)好,65d滿袋,平均生長(zhǎng)速度達(dá)4.32±1.54mm/d,子實(shí)體直徑0.3–1.6cm,菌蓋淡褐色,菌柄灰白色,其長(zhǎng)度、直徑分別達(dá)0.3–3.12cm和0.5–1.5cm;子實(shí)體產(chǎn)量和生物學(xué)效率分別為23.24g/袋和4.56%。(4)采用Illumina MiSeq高通量測(cè)序技術(shù)結(jié)合生物信息學(xué)對(duì)棱柄馬鞍菌子實(shí)體根際土壤真菌群落組成及多樣性進(jìn)行了分析,結(jié)果表明:5個(gè)樣本之間共有分類操作單元(Operational Taxonomic Unit,OTU)182個(gè),樣本5中特有OTU最多,為201個(gè),樣本1中特有OTU最少,僅59個(gè)。樣本5和樣本2種群豐度高于其余3個(gè)樣本(P0.05)。樣本1中特有的真菌屬有Halokirschsteiniothelia;樣本2中特有的真菌屬有Plectania、Heydenia、Trichosporon、Clavaria,Thelonectria、Leucoglossum、Lepiota、Tricholoma;樣本3中特有的真菌屬有Metarhizium、Ceratocystis、Cadophora、Cercophora、Podospora;樣本4中特有的真菌屬有Hypxylon、Physciella、Cyphellophora、Phyragmocephala、Alternaria、Guttulispora、Ophiostoma、Tomentella、Caluatia、Thermomyces、Auxarthron、Botrytis、Scleromitrula、Schizothecium、Chaetomium、Glomerella、Acremonium、Cosllarina;樣本5中特有的真菌屬有Hirsutella、Porormia、Pseudodictyosporium、Lophiotrema。5個(gè)樣本中優(yōu)勢(shì)菌群均屬于子囊菌門(Ascomycota)、擔(dān)子菌門(Basidiomycota)和接合菌門(Zygomycota),以上菌群在5個(gè)樣本中的分布存在差異,但相對(duì)含量均大于5%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,不同采樣地棱柄馬鞍菌根際土壤真菌多樣性和物種豐度差異明顯(P0.05),沒有子實(shí)體生長(zhǎng)的土壤,其真菌多樣性高于生長(zhǎng)過棱柄馬鞍菌的土壤,且不同土壤樣本中優(yōu)勢(shì)菌屬種類與豐度不一樣,可見棱柄馬鞍菌對(duì)于根際定殖真菌具有一定選擇性。(5)以液態(tài)發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基為對(duì)照,以菌絲體生物量和胞外多糖(Exopolysaccharides,EPS)含量作為評(píng)價(jià)指標(biāo),通過單因素試驗(yàn)與響應(yīng)面法對(duì)X1菌株液體搖瓶發(fā)酵過程中最適碳氮源以及添加量進(jìn)行了優(yōu)化。研究結(jié)果表明,當(dāng)發(fā)酵配方為:1000mL馬鈴薯和松針煮汁、28.58g葡萄糖、2.77g蛋白胨、3.01g酵母浸膏、1g KH_2PO_4、1g NaHCO_3、0.5g MgSO_4和0.01g維生素B_1時(shí),X1菌株的菌絲體生物量最高,可達(dá)11.01g/L,是對(duì)照組的8.83倍;當(dāng)發(fā)酵配方為:1000mL馬鈴薯和松針煮汁、28.49g/L葡萄糖、3.54g蛋白胨、3.85g酵母浸膏、1g KH_2PO_4、0.5g MgSO_4和0.01g維生素B_1時(shí),EPS含量最高,可達(dá)233.25mg/L,是對(duì)照組的4.06倍。在此基礎(chǔ)上,采用正交試驗(yàn)對(duì)其菌絲體液態(tài)培養(yǎng)條件進(jìn)行了優(yōu)化,得出X1菌株的最佳液態(tài)培養(yǎng)條件為:接種量20%,裝液量80mL,轉(zhuǎn)速140r/min。經(jīng)驗(yàn)證試驗(yàn)得出,在優(yōu)化后的發(fā)酵工藝下,X1菌株的菌絲體生物量和EPS含量可高達(dá)11.86g/L和244.56mg/L,分別是對(duì)照組的9.59和4.31倍。(6)以X1菌株為發(fā)酵菌株,以山西常見的10種谷物(小麥、大米、燕麥、玉米、小米、藜麥、蕎麥、大豆、豌豆和高粱)為發(fā)酵基質(zhì),對(duì)比研究了X1菌株通過固態(tài)發(fā)酵對(duì)發(fā)酵基質(zhì)總酚含量和抗氧化性能的影響。結(jié)果表明,經(jīng)X1菌株固態(tài)發(fā)酵后,小米、燕麥、藜麥、小麥和大豆發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量與發(fā)酵時(shí)間呈現(xiàn)出較顯著的正相關(guān)性,相關(guān)系數(shù)(R)分別為0.930、0.898、0.911、0.764和0.770。發(fā)酵35d后,5種發(fā)酵谷物的總酚含量達(dá)到最大值:3.38mg/g、3.30mg/g、1.30mg/g、3.06mg/g和0.57mg/g,分別比對(duì)照高1.57、2.21、1.86、2.03和1.10倍。大米、蕎麥和豌豆發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量與發(fā)酵時(shí)間呈正相關(guān)(R分別為0.435、0.398和0.132);玉米和高粱發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量與發(fā)酵時(shí)間呈負(fù)相關(guān)(R=-0.399和-0.723)。發(fā)酵7d后,玉米發(fā)酵產(chǎn)物總酚含量的最大值為3.18mg/g,比對(duì)照低0.3%;高粱發(fā)酵產(chǎn)物的總酚含量最大值為2.68mg/g,比對(duì)照低12%。以DPPH·清除能力、還原力、O_2~-·清除能力和Fe~(2+)螯合能力為指標(biāo),對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物進(jìn)行體外抗氧化性能分析,結(jié)果表明,10種谷物發(fā)酵產(chǎn)物中,小麥發(fā)酵產(chǎn)物提取物的DPPH·清除能力最強(qiáng),EC_(50)值為0.16mg/mL,比對(duì)照組降低了98.78%;豌豆發(fā)酵產(chǎn)物提取物的還原力最強(qiáng),EC_(50)值為4.18mg/mL,比對(duì)照組降低了56.56%;小米發(fā)酵產(chǎn)物提取物的Fe~(2+)螯合能力最強(qiáng),EC_(50)值達(dá)16.64mg/mL,比對(duì)照組降低了81.61%;高粱發(fā)酵產(chǎn)物提取物的O_2~-·清除能力最強(qiáng),EC_(50)值為12.41mg/mL,比對(duì)照組降低了53.82%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,X1菌株固態(tài)發(fā)酵可以有效改善發(fā)酵基質(zhì)的總酚含量和抗氧化性能。本研究結(jié)果表明,棱柄馬鞍菌不僅子實(shí)體營(yíng)養(yǎng)豐富,含有多種氨基酸和微量元素,其菌絲體的固態(tài)發(fā)酵還可以有效改善發(fā)酵基質(zhì)的抗氧化性能,因而,本研究既可以為開發(fā)利用棱柄馬鞍菌菌株提供理論依據(jù),還可以為開發(fā)谷物抗氧化產(chǎn)品或功能食品提供科學(xué)指導(dǎo)。
【學(xué)位單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：S646.11;TQ920.6;TS219
【部分圖文】：

分類上絕大多數(shù)屬于擔(dān)子菌門，如雙孢蘑菇（Agaricudodes）和黑木耳（Auricularia auricula）等；少數(shù)屬于子lla esculenta）、蛹蟲草（Cordyceps militaris）和馬鞍菌（H子實(shí)體由兩部分組成，分別是菌蓋和菌柄，如圖 1.1 所

圖 1.3 蕈菌 rDNA 的結(jié)構(gòu)[33]Fig 1.3 The structure of rDNA in mushroomsParnmen 等[36]采用 ITS 鑒定法對(duì)冷凍干燥的蕈菌子實(shí)體進(jìn)行了分類鑒定。

圖 1.4 中國(guó)馴化的野生食藥用菌數(shù)量在世界總量中所占的比例Fig 1.4 The proportion of wild edible and medical fungus domesticated of China in the World中國(guó)地大物博，蕈菌數(shù)量更是遙居世界首位，但已經(jīng)實(shí)現(xiàn)人工栽培的種類僅占
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本文編號(hào)：2849837