β-葡聚糖酶能夠水解大麥等谷物中β-葡聚糖,在啤酒釀造及飼料工業(yè)中用于β-葡聚糖的降解以降低粘度改善生產(chǎn)工藝及產(chǎn)品性能。在啤酒釀造中,β-葡聚糖酶主要在糖化階段使用,因此需要耐受糖化階段的高溫酸性環(huán)境。在飼料工業(yè)中,β-葡聚糖酶雖然主要在動物腸道的中性環(huán)境中發(fā)揮作用,但需要耐受飼料造粒階段的高溫環(huán)境及動物胃部的酸性環(huán)境。目前工業(yè)應用的β-葡聚糖酶對高溫和酸性環(huán)境的耐受力尚不能充分滿足工業(yè)應用的要求,耐熱性和耐酸性水平更高的β-葡聚糖酶具有一定的工業(yè)應用前景。本文主要利用黑曲霉基因組信息,從黑曲霉中克隆并鑒定具有更高耐熱性的β-葡聚糖酶編碼基因,進一步采用高拷貝整合等方法,探索構建β-葡聚糖酶高表達重組畢赤酵母的方法。論文的主要結果如下:(1)以黑曲霉(A.niger CBS 513.88)基因組信息為依據(jù)設計引物,通過RT-PCR技術,逐個克隆黑曲霉(A.niger CICIM F0510)基因組中可能編碼葡聚糖酶的基因,在畢赤酵母中誘導表達,鑒定重組酶性質(zhì)。鑒定獲得一種新型耐熱性的葡聚糖酶編碼基因eglA6,其所編碼的重組酶AnEglA6的耐熱性和耐酸性明顯超過黑曲霉中已發(fā)現(xiàn)的葡聚糖酶。(2)根據(jù)巴斯德畢赤酵母的密碼子偏好性對eglA6基因進行優(yōu)化,密碼子優(yōu)化后的基因命名為eglA6b,在畢赤酵母中表達eglA6b基因,經(jīng)過密碼子優(yōu)化后葡聚糖酶的表達量提高了1.8倍。重組酶AnEglA6的最適溫度為75℃,最適pH為4.0,表觀分子量約為52 kDa。以大麥葡聚糖為底物時,重組酶AnEglA6比酶活為12450.6 U·mg~(-1),K_m和V_(max)分別為19.1 mg·m L~(-1)和5.9 mmol·min~(-1)·mg~(-1);以CMC-Na為底物時,比酶活為1645.7 U·mg~(-1),K_m和V_(max)分別為43.1 mg·m L~(-1)和2.6 mmol·min~(-1)·mg~(-1);以地衣多糖和燕麥葡聚糖為底物時,AnEglA6比酶活分別為17445.2 U·mg~(-1)和12004.1 U·mg~(-1)。在70℃和75℃下酶活半衰期分別為4.6 h和1.9 h。Co~(2+)、Mn~(2+)對酶活有一定的促進作用,Fe~(3+)對酶活有較明顯的抑制作用。(3)采用兩步同源重組技術,依次刪除畢赤酵母高表達菌株Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6b HB133的URA3、TRP1基因,構建了URA3單缺失菌株和URA3、TRP1雙缺失菌株,同時分別以URA3、TRP1基因作為篩選標記,構建葡聚糖酶基因表達盒pPIC9K-eglA6b-TRP1及pPIC9K-eglA6b-URA3,依次轉化后得到高表達菌株Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6b HB133 S6,與出發(fā)菌株HB133相比,酶活提高了12.1%。(4)分別在搖瓶水平和5 L發(fā)酵罐水平對重組菌Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6b HB133 S6發(fā)酵條件進行了優(yōu)化。搖瓶條件下,當初始pH為6.0,甲醇添加量為1.5%,葡聚糖酶的酶活達到最高3603.9 U·mL~(-1)。5 L發(fā)酵罐條件下,經(jīng)優(yōu)化后,當發(fā)酵罐pH為4.5,菌體濃度OD_(600)為360,以10 m L·h~(-1)·L~(-1)的速度補加甲醇,重組菌產(chǎn)葡聚糖酶酶活達到最高33031.8 U·mL~(-1),是搖瓶條件下的9.17倍。本文獲得了一種在酸熱條件下具有較高穩(wěn)定性和活性的重組葡聚糖酶AnEglA6,并構建了一株高表達AnEglA6的重組巴斯德畢赤酵母。AnEglA6在飼料、啤酒工業(yè)及其它在高溫酸性條件進行的生物加工工藝中有一定的應用前景。
【學位單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925
【部分圖文】：

在畢赤酵母中的表達白在 N 端均有一段信號增基因的成熟肽編碼區(qū)并、Peg10 擴增基因 eglA6 達載體 pPIC9K-eglA6 和性化表達載體 pPIC9K-e30℃培養(yǎng)，直至出現(xiàn)轉化30℃、200r·min-1條件下中誘導，120h 后結束誘圖中可以看出，pPIC9K間，轉化子平均酶活為 6葡聚糖酶 cDNA 基因的 RT-PPCR of the glucanase gene eglr；1：葡聚糖酶基因 eglA6；

(a) (b)圖 3-2 重組質(zhì)粒 pPIC9K-eglA6(a)和 pPIC9K-eglA8(b)轉化子酶活Fig. 3-2 Enzyme activity of recombinant Pichia pastoris GS115/pPIC9K-eglA6 and Pichia pastorisGS115/pPIC9K-eglA8將獲得的葡聚糖酶粗酶液進行 SDS-PAGE 電泳，結果如圖 3-3 所示，兩種葡聚糖酶基因均成功在畢赤酵母中實現(xiàn)了較高水平的表達。

18聚糖酶的 SDS-PAGE 鑒定alysis of the recombinant AnEPichia pastoris GS115/pPICS115/pPIC9K-eglA8 cultur與重組酶的純化根據(jù)巴斯德畢赤酵母的名為 eglA6b，其序列已體 pPIC9K 連接，獲得重隨機挑選其中 20 個轉，14 個轉化子表現(xiàn)出較lA6 的轉化子平均酶活為
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本文編號：2849830