發(fā)布時(shí)間：2020-10-17 04:57

　　 絲狀真菌米曲霉是發(fā)酵工業(yè)的重要菌種,具有良好的蛋白分泌能力和較高的食品安全性。本研究應(yīng)用分子生物學(xué)技術(shù),重組構(gòu)建了5株新型米曲霉工程菌,將其應(yīng)用于豆粕原料的發(fā)酵,比較和研究了外源蛋白酶基因的導(dǎo)入對(duì)米曲霉發(fā)酵作用的影響,并對(duì)菌株所表達(dá)的外源蛋白酶進(jìn)行了分離純化及酶學(xué)特性的研究。研究結(jié)果對(duì)于以米曲霉為宿主的外源基因的轉(zhuǎn)化和調(diào)控,以及米曲霉優(yōu)良菌株的選育具有重要的意義。本研究首先應(yīng)用PCR擴(kuò)增的方法從地衣芽胞桿菌、短小芽孢桿菌和黑曲霉中擴(kuò)增到了3個(gè)堿性蛋白酶基因和3個(gè)酸性蛋白酶基因。運(yùn)用生物信息學(xué)的方法對(duì)蛋白酶基因進(jìn)行序列分析和氨基酸序列預(yù)測(cè)。以雙元表達(dá)載體pCAMBIA1304為載體骨架,通過連入米曲霉高效表達(dá)元件淀粉酶啟動(dòng)子和糖苷酶終止子構(gòu)建米曲霉表達(dá)閱讀框。在表達(dá)閱讀框中分別連入單個(gè)外源蛋白酶基因,構(gòu)建了4個(gè)表達(dá)載體paa-subC、paa-asp、paa-Ap、paa-pep。采用以自剪切肽(T2A肽)作為連接的策略,將兩個(gè)堿性蛋白酶基因subC和asp連入表達(dá)載體中,構(gòu)建了堿性蛋白酶串聯(lián)表達(dá)載體paa-sTa,以研究多順反子載體在米曲霉中的表達(dá)情況。絲狀真菌遺傳轉(zhuǎn)化系統(tǒng)較為復(fù)雜,相同的轉(zhuǎn)化方法在不同種屬間的轉(zhuǎn)化效率差別較大,甚至在不同亞種之間也會(huì)有很大差異。本研究對(duì)米曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化體系進(jìn)行了研究,應(yīng)用根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法轉(zhuǎn)染米曲霉,以潮霉素作為篩選標(biāo)記,并對(duì)影響轉(zhuǎn)化效率的米曲霉孢子濃度、農(nóng)桿菌菌液濃度、共培養(yǎng)時(shí)間、共培養(yǎng)溫度等條件進(jìn)行優(yōu)化,建立了根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)的米曲霉遺傳轉(zhuǎn)化體系。結(jié)果顯示在預(yù)培養(yǎng)時(shí)加入誘導(dǎo)劑乙酰丁香酮可顯著提高轉(zhuǎn)化效率,當(dāng)根瘤農(nóng)桿菌的OD_(600)為0.6,米曲霉孢子濃度為10~7/m L個(gè)孢子,28℃時(shí)共培養(yǎng)3d,轉(zhuǎn)化效率最高。驗(yàn)證結(jié)果顯示外源目的基因已成功導(dǎo)入米曲霉基因組中,說(shuō)明根瘤農(nóng)桿菌介導(dǎo)的方法可以應(yīng)用于米曲霉轉(zhuǎn)化系統(tǒng),研究結(jié)果為米曲霉的遺傳轉(zhuǎn)化提供了新的途徑,對(duì)曲霉類絲狀真菌的遺傳轉(zhuǎn)化具有一定的借鑒作用。利用構(gòu)建的米曲霉重組工程菌發(fā)酵底物豆粕,考察不同菌株發(fā)酵的蛋白酶活力、多肽轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵產(chǎn)物分子量組成及抗氧化活性。研究結(jié)果顯示外源蛋白酶基因的導(dǎo)入可顯著提高米曲霉工程菌的蛋白酶活力,其中米曲霉asp堿性蛋白酶活力為165U/mL,與野生型米曲霉相比提高了140%;米曲霉pep的酸性蛋白酶活力為143U/mL,比野生型提高了242%。改造后的工程菌對(duì)原料的水解效率和多肽產(chǎn)品的轉(zhuǎn)化率也有所提高,米曲霉pep的多肽轉(zhuǎn)化率達(dá)到35.89%,為野生型的2倍。發(fā)酵產(chǎn)物氨基酸含量分析結(jié)果顯示不同菌株發(fā)酵產(chǎn)品中游離氨基酸總量、必需氨基酸總量均存在差異。發(fā)酵豆粕SDS-PAGE電泳分析及掃描電鏡觀察結(jié)果顯示,基因工程改造可加強(qiáng)菌株對(duì)底物的水解作用。應(yīng)用超濾及凝膠過濾的方法,對(duì)不同工程菌發(fā)酵豆粕后的產(chǎn)物進(jìn)行分離,并對(duì)分離后的各組分的抗氧化活性進(jìn)行比較。結(jié)果顯示米曲霉pep發(fā)酵獲得的小分子肽比例較大;與野生型米曲霉發(fā)酵產(chǎn)物相比,各工程菌發(fā)酵產(chǎn)物不同組分的抗氧化活性均有不同程度提高,其中米曲霉pep發(fā)酵產(chǎn)物組分Ⅰ抗氧化活性較好。為進(jìn)一步提高菌株發(fā)酵性能,應(yīng)用響應(yīng)面法對(duì)米曲霉pep發(fā)酵豆粕產(chǎn)多肽的條件進(jìn)行優(yōu)化,結(jié)果顯示當(dāng)發(fā)酵時(shí)間為108h,發(fā)酵溫度31℃,接菌量為8%時(shí),多肽轉(zhuǎn)化率達(dá)40.4%。選取蛋白酶活力相對(duì)較高的米曲霉工程菌asp和米曲霉pep,應(yīng)用硫酸銨鹽析、DEAE陰離子交換層析和葡聚糖凝膠層析對(duì)所表達(dá)的堿性蛋白酶ASP和酸性蛋白酶PEP進(jìn)行了分離純化,并對(duì)其酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了初步研究。電泳結(jié)果顯示重組堿性蛋白酶分子量約為31 kD,重組酸性蛋白酶分子量約為40 kD;兩種酶的純化倍數(shù)分別為5.64倍和3.85倍,分別對(duì)純化的兩種蛋白酶的酶學(xué)性質(zhì)進(jìn)行了研究。所獲得結(jié)果對(duì)于利用米曲霉作為外源基因表達(dá)的細(xì)胞工廠,探索外源基因在米曲霉中的轉(zhuǎn)化、表達(dá)和調(diào)控具有一定的參考價(jià)值。
【學(xué)位單位】：沈陽(yáng)農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925
【部分圖文】：

圖 1-2 2A 肽在多順反子載體構(gòu)建中的裂解機(jī)制Fig.1-2 Mechanism of self-processing of 2Apeptide in construction of polycistron expression vect

微生物蛋白酶.1 微生物蛋白酶的分類蛋白酶的主要作用是催化蛋白質(zhì)水解，在水解底物大分子時(shí)獲得小分子的微生物蛋白酶作為蛋白酶的主要來(lái)源被廣泛研究。按照酶切位點(diǎn)的不同，蛋白酶分為內(nèi)肽酶和外肽酶；根據(jù)催化機(jī)制的不同又可將微生物蛋白酶分酶、半胱氨酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、金屬蛋白酶。目前較廣泛的是按同將其分為堿性蛋白酶、中性蛋白酶和酸性蛋白酶(Sabotic，2012)。.2 堿性蛋白酶圖 1-3 不同 2A 肽的 DNA 序列及其相應(yīng)氨基酸組成Fig.1-3 DNAand corresponding amino acid sequences of various 2Apeptides

2.2.1 堿性蛋白酶基因擴(kuò)增的結(jié)果2.2.1.1 地衣芽胞桿菌堿性蛋白酶基因 subC、aprB 擴(kuò)增的結(jié)果從地衣芽孢桿菌細(xì)胞中提取基因組DNA，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，結(jié)果如圖2-1所示，所提取DNA質(zhì)量較好，可以作為PCR擴(kuò)增的模板使用。以地衣芽孢桿菌細(xì)胞基因組DNA為模板，PCR擴(kuò)增subC基因，結(jié)果如圖2-2所示，通過擴(kuò)增在1000-2000bp之間獲得一DNA條帶，大小如文獻(xiàn)相符，將其回收后與測(cè)序載體連接進(jìn)行測(cè)序。同樣方法獲得的aprB基因片段如圖2-3所示，其大小與預(yù)期基因大小一致，回收后測(cè)序。1500025001000250M 1 2圖 2-1 地衣芽孢桿菌基因組 DNA 檢測(cè)結(jié)果Fig.2-1 Result of Bacillus lich
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2844307