植物病毒病是造成農(nóng)業(yè)生產(chǎn)損失的最嚴(yán)重病害之一,有“植物癌癥”之稱。微生物作為天然活性產(chǎn)物的重要生物資源庫,從中開發(fā)出高效、低毒、廣譜、安全的抗植物病毒劑一直是植物病毒病防治領(lǐng)域的熱點(diǎn)。鏈霉菌ZX01(Streptomyces kanasensis ZX01)是西北農(nóng)林科技大學(xué)無公害農(nóng)藥研究服務(wù)中心從新疆喀納斯湖附近的土壤中篩選到的一株具有抗煙草花葉病毒(Tobacco mosaic virus,TMV)活性的新型鏈霉菌,采用活性跟蹤法從該菌株的發(fā)酵產(chǎn)物中分離到了活性成分——糖蛋白GP-1。本文在課題組前期研究的基礎(chǔ)上,以鏈霉菌ZX01為供試菌株,從培養(yǎng)基優(yōu)化、發(fā)酵條件控制、發(fā)酵規(guī)模擴(kuò)大等方面進(jìn)行研究,以期最大程度地提高糖蛋白GP-1的產(chǎn)量,并以糖蛋白GP-1為有效成分研制出一種新型的抗植物病毒制劑。本文的主要結(jié)果如下:(1)對(duì)鏈霉菌ZX01產(chǎn)糖蛋白GP-1的搖瓶發(fā)酵工藝進(jìn)行了初步研究,確定了其種子培養(yǎng)基、發(fā)酵培養(yǎng)基以及搖瓶發(fā)酵條件。種子培養(yǎng)基成分為:可溶性淀粉20 g/L、NaCl0.5 g/L、FeSO_4·7H_2O 0.01 g/L、K_2HPO_4 0.5 g/L、KNO_3 1 g/L、MgSO_4·7H_2O 0.5 g/L,種齡72 h;發(fā)酵培養(yǎng)基為成分為:可溶性淀粉13.6 g/L、酵母粉4.2 g/L、NaCl 3.5 g/L、CaCO_3 0.3 g/L、小米10 g/L;發(fā)酵條件為:接種量6%、初始pH6.5、搖床轉(zhuǎn)速150 rpm。在最佳搖瓶發(fā)酵工藝下發(fā)酵7 d,糖蛋白GP-1的產(chǎn)量達(dá)到了0.93 mg/L,相比于優(yōu)化之前(0.35 mg/L)提高了168%。(2)對(duì)鏈霉菌ZX01產(chǎn)糖蛋白GP-1的發(fā)酵罐操作工藝進(jìn)行了優(yōu)化,在5 L發(fā)酵罐上研究了溫度、攪拌速度和通氣量對(duì)糖蛋白GP-1產(chǎn)量的影響,確定了最佳操作工藝為:溫度30℃、攪拌速度200 rpm、通氣量2.0 vvm。采用以上控制條件進(jìn)行4批驗(yàn)證試驗(yàn),得到的平均糖蛋白GP-1的產(chǎn)量為3.92 mg/L,相當(dāng)于搖瓶發(fā)酵水平的4.2倍。(3)采用恒定的體積氧傳遞系數(shù)(k_La)作為放大準(zhǔn)則,成功實(shí)現(xiàn)了鏈霉菌ZX01產(chǎn)糖蛋白GP-1的中試發(fā)酵放大,發(fā)酵規(guī)模從5 L逐級(jí)放大到15 L和70 L,糖蛋白GP-1的產(chǎn)量相對(duì)穩(wěn)定,分別達(dá)到了3.92 mg/L、4.03 mg/L、3.82 mg/L。(4)在5 L發(fā)酵罐中研究了鏈霉菌ZX01的發(fā)酵動(dòng)力學(xué),分別采用Logistic方程和Luedeking-Piret方程建立了其細(xì)胞生長與產(chǎn)物形成動(dòng)力學(xué)模型,能較好地反映鏈霉菌ZX01發(fā)酵合成糖蛋白GP-1的過程。細(xì)胞生長動(dòng)力學(xué)模型:(?)糖蛋白GP-1合成動(dòng)力學(xué)模型:(?).(5)研制出一種以糖蛋白GP-1為有效成分的新型抗植物病毒劑——0.5%糖蛋白GP-1水劑,其配方為:0.5%糖蛋白GP-1(有效成分)、5%烷基糖苷APG(表面活性劑)、1%卡松(防腐劑)、1%乙二醇(防凍劑)、1%聚二甲基硅氧烷(消泡劑)、自來水補(bǔ)足至100%(溶劑)。(6)室內(nèi)盆栽與田間小區(qū)試驗(yàn)均表明0.5%糖蛋白GP-1水劑在防治煙草花葉病毒病方面表現(xiàn)出很好的持效性。制劑的200倍稀釋液對(duì)TMV的室內(nèi)防效在藥后的5 d、10d及15 d分別達(dá)到了76.28%、75.73%、67.85%,對(duì)TMV的田間防效在藥后的第10 d、20 d及30 d分別為42.39%、47.40%和43.09%。綜上所述,本文圍繞鏈霉菌ZX01生產(chǎn)糖蛋白GP-1的發(fā)酵過程進(jìn)行系統(tǒng)的研究,不但提高糖蛋白GP-1的產(chǎn)量,還擴(kuò)大了其發(fā)酵生產(chǎn)規(guī)模,為實(shí)現(xiàn)其工業(yè)化生產(chǎn)提供一定理論基礎(chǔ)和技術(shù)支持。另外,在此基礎(chǔ)上研制出的抗植物病毒劑,為完善植物病毒病的綜合防治提供依據(jù)。
【學(xué)位單位】：西北農(nóng)林科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.6;TQ458
【部分圖文】：

善植物病毒病的綜合防治提供參考。本文的主要研究工作將用單次單因子和響應(yīng)面分析相結(jié)合的統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)方法，對(duì)鏈霉菌行優(yōu)化，主要研究培養(yǎng)基和搖瓶條件對(duì)糖蛋白 GP-1 產(chǎn)量的影響搖瓶優(yōu)化試驗(yàn)的結(jié)果為基礎(chǔ)，在 5L 發(fā)酵罐中對(duì)鏈霉菌 ZX01 優(yōu)化，主要研究溫度、攪拌速度、通氣量等對(duì)糖蛋白 GP-1 產(chǎn)量 5 L 發(fā)酵罐研究的基礎(chǔ)上，將鏈霉菌 ZX01 產(chǎn)糖蛋白 GP-1 的發(fā)酵規(guī)模逐級(jí)擴(kuò)大到 70 L。 5L 發(fā)酵罐中研究鏈霉菌 ZX01 的發(fā)酵動(dòng)力學(xué)，建立其細(xì)胞生型。糖蛋白 GP-1 為有效成分進(jìn)行抗植物病毒制劑的研制，并對(duì)制測以驗(yàn)證產(chǎn)品質(zhì)量的合格性，通過室內(nèi)盆栽試驗(yàn)以及田間藥效草花葉病毒病的防治效果。技術(shù)路線如下：

圖 2-1 10 種培養(yǎng)基對(duì)鏈霉菌 ZX01 細(xì)胞干重的影響Fig.2-1 Effects of 10 media on DCW of Streptomyces kanasensis ZX01 h 的搖瓶培養(yǎng)，ZX01 菌株在種子培養(yǎng)基中均形成了直徑 1~5搖床旋轉(zhuǎn)時(shí)產(chǎn)生的離心作用，很多菌絲都附著到了瓶壁上進(jìn)行看出高氏一號(hào)培養(yǎng)基、ISP4 培養(yǎng)基和 ISP3 培養(yǎng)基均能提供殖的環(huán)境，它們中的細(xì)胞干重分別為 6.18 ± 0.09、6.02 ± 0.19 培養(yǎng)基具有個(gè)共同點(diǎn)：成分中無氮源，卻含有多種無機(jī)鹽提供01 菌株的生長繁殖對(duì)于氮源的需求并不高，反而是無機(jī)離子長。最后，綜合考慮試驗(yàn)結(jié)果和配方成本，確定高氏一號(hào)培養(yǎng)殖的最適種子培養(yǎng)基。生長曲線和種齡的確定一號(hào)為種子培養(yǎng)基對(duì)鏈霉菌 ZX01 進(jìn)行 120 h 的培養(yǎng)，并對(duì)培測定，結(jié)果如圖 2-2 所示。ZX01 菌株的生長分為 4 個(gè)時(shí)期：0長速度較低，只有 0.0308 g/(L·h)；12~84 h 為對(duì)數(shù)期，細(xì)胞生h)；84~96 h 為穩(wěn)定期，細(xì)胞生長速度慢慢降低，并在 96 h 時(shí)達(dá)

圖 2-3 10 種培養(yǎng)基對(duì)糖蛋白 GP-1 產(chǎn)量的影響Fig.2-3 Effect of 10 media on glycoprotein GP-1 production養(yǎng)基對(duì)糖蛋白 GP-1 產(chǎn)量的影響如圖 2-3 所示。結(jié)果表明，GP-最高，達(dá)到了 0.3454mg/L，與其他培養(yǎng)基有顯著的差異；其次105 mg/L）和黃豆粉培養(yǎng)基（0.3003 mg/L），它們中的 GP-1 ；ISP1~ISP6 培養(yǎng)基的 GP-1 產(chǎn)量分別為 0.2575 mg/L、0.26432 mg/L、0.2103 mg/L 以及 0.2850 mg/L；相比之下，以高氏一 產(chǎn)量只有 0.1907mg/L。一般來說，如果培養(yǎng)基中營養(yǎng)物質(zhì)過長，從而抑制代謝產(chǎn)物的合成，如果營養(yǎng)物質(zhì)過少，則細(xì)胞易32

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本文編號(hào)：2828798