微生物角蛋白酶底物廣泛,既能降解可溶性蛋白,又能降解不可溶蛋白,因此在清潔劑、制革業(yè)、紡織業(yè)、飼料添加劑等行業(yè),角蛋白酶能更好地替代傳統(tǒng)蛋白酶;由于角蛋白酶能降解普通蛋白酶難以降解的富含角蛋白的羽毛、羊毛、蹄甲、毛發(fā),因此被廣泛應(yīng)用于制革業(yè)、紡織業(yè)和角蛋白廢棄物的處理。直至目前,篩選、發(fā)掘、研究有角蛋白酶生產(chǎn)能力的微生物菌株,以及繼續(xù)開發(fā)這些菌株產(chǎn)的有潛在工業(yè)、商業(yè)應(yīng)用潛力的角蛋白酶資源,仍是角蛋白酶研究中的重要的、待解決的問題。本實驗室保存有多株角蛋白酶高產(chǎn)菌株,本研究選擇其中有代表性的3株進行研究。1、枯草芽孢桿菌Y3-4(Bacillus sbutilis Y3-4)既能很好地降解羊毛(α-角蛋白),也能很好地降解羽毛(β-角蛋白),為更好地研究其角蛋白酶性質(zhì),我們對該菌胞外發(fā)酵液進行部分純化,研究了粗酶液的最適酶活溫度等基本酶學(xué)性質(zhì),以及還原劑、去垢劑等對該酶的影響,并對角蛋白酶在降解角蛋白廢棄物等方面的應(yīng)用能力進行了評價。2、枯草芽孢桿菌FJ-3-16(Bacillussubtilis FJ-3-16)產(chǎn)的主要角蛋白酶KerFJ比活高、抗逆性好、在角蛋白廢棄物降解、洗滌劑添加劑和酶法脫毛方面具有很好的應(yīng)用潛力。本論文通過單因子實驗、Plackett-Burman(PB)設(shè)計和響應(yīng)面法(Response surface method,RSM)優(yōu)化了B.subti is FJ-3-16 的產(chǎn)酶條件,并建立了50 L發(fā)酵罐的產(chǎn)酶工藝,同時研究了該菌發(fā)酵液對難脫毛生豬(巴馬香豬)豬皮及豬蹄的脫毛效果。在優(yōu)化原始菌株產(chǎn)酶條件的基礎(chǔ)上,本論文還對該菌產(chǎn)的角蛋白酶KerFJ在畢赤酵母中的異源表達進行了研究。3、蠟樣芽孢桿菌Y-15(BacilluscereusY-15)是本實驗室在某食品廠長期浸沒羽毛的排污管淤泥中分離得到的一株菌,具有很好的羽毛降解能力。本論文利用目視觀察和電鏡觀察了降解過程中羽毛底物結(jié)構(gòu)的破壞,并利用RSM方法優(yōu)化其產(chǎn)酶條件,為該菌株進一步的應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。本論文研究結(jié)果如下:1、B.subtilis Y3-4胞外部分純化獲得的角蛋白酶催化角蛋白水解的最適反應(yīng)溫度和pH分別為55℃和pH8.0,說明該酶屬于中溫堿性蛋白酶;該酶在pH 6.0～10.0范圍內(nèi)穩(wěn)定性很好,溫度超過50℃時酶活喪失很快。PMSF能夠抑制其90%酶活,而專一性Zn螯合劑性鄰菲羅啉(1,10-Phenanthrolinemonohydrate,O-P)對其酶活幾乎無影響,這些抑制劑實驗表明該酶屬于絲氨酸蛋白酶。金屬離子螯合劑EDTA、EGTA抑制80%-90%角蛋白酶活性,金屬離子實驗表明Cu2+、K2+、Ca2+能提高Y3-4酶液的酶活,而Ni2+和Co2+對其有明顯抑制作用。該酶耐受氧化劑H2O2、NaClO、Sodium cholate能力弱,在還原劑DTT、β-ME和DTNB存在時酶活有所提高或基本不變,說明該酶具有一定的抗逆性。該酶在大部分洗衣液中穩(wěn)定性良好,并且作為洗滌劑添加劑具有很好的去污效果。此外,該酶還能夠?qū)ρ蚱っ撁?具有酶法脫毛的應(yīng)用潛力。2、優(yōu)化后的B.subtilsFJ-3-16培養(yǎng)基配方為:豆粉3.62%、酪素2%、玉米粉 1.41%、CaC120.16%、KH2PO4 0.1%、K2HPO40.3%,在 37℃,250r/min 條件下培養(yǎng)48h獲得最大酶活,酶活由原有的73.82U/mL提高至166.08U/mL,提高了 1.25倍。本論文建立了 50 L發(fā)酵罐發(fā)酵產(chǎn)酶工藝,酶活進一步由166.08 U/mL提高到207.6 U/mL,提高了 0.44倍,同時產(chǎn)酶時間由48 h縮短至18 h。B.subtilisFJ-3-16粗酶液對巴馬香豬小塊皮張的脫毛以及對整蹄具有優(yōu)異的脫毛效果:6 h完成小塊皮張的脫毛,10 h可完成整蹄脫毛,20 L發(fā)酵液可一次性處理巴馬香豬豬蹄/豬皮/豬頭約40 kg,脫毛后的皮張品相完整、賣相佳。本論文揭示B.subtilis FJ-3-16在巴馬香豬為代表的難脫毛生豬的脫毛中具有極好的應(yīng)用前景,為實現(xiàn)角蛋白酶的工業(yè)化應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。本實驗室對B.subtilis FJ-3-16基因組進行測序,獲得了角蛋白酶kerFJ基因序列。本研究克隆得到該基因,成功構(gòu)建重組載體pPICZαA-kerFJ,并轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115,驗證得到8株重組菌株。3、B.cereusY-15可在以羽毛為唯一碳氮源的培養(yǎng)基中迅速生長,48h時羽毛降解率為47.5%,培養(yǎng)至120 h降解率達90.7%,說明該菌能高效降解羽毛廢棄物。目視觀察和電鏡觀察表明降解過程中羽毛的羽枝、羽軸和整體結(jié)構(gòu)破壞嚴重。利用RSM優(yōu)化培養(yǎng)基后得到配方為:豆粕0.88%、玉米粉2.23%、麩皮2%、KH2PO40.1%、CaCl2 0.22%、K2HPO40.1%,產(chǎn)酶提高了 20 倍。對粗酶液酶學(xué)性質(zhì)的研究表明,該酶的耐熱性較好,70℃條件下半衰期為20 min。該酶的pH穩(wěn)定性良好,對去垢劑等有著很好耐受性,這些性質(zhì)使得B.cereusY-15及其角蛋白酶在角蛋白廢棄物降解方面具有發(fā)展前景。
【學(xué)位單位】：山東大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ925.2
【部分圖文】：

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【參考文獻】

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本文編號：2828503