Baeyer-Villiger單加氧酶(BVMO)作為一種重要的生物催化劑,具有選擇性高、反應(yīng)條件溫和、高效等優(yōu)點,可以催化各種有機酮/醛化合物的Baeyer-Villiger氧化反應(yīng),以及一些含硫、硒、硼等雜原子底物的非天然氧化反應(yīng)。BVMO催化的選擇性氧化反應(yīng)已被廣泛應(yīng)用于各種手性化合物的合成中。近年來,利用生物信息學(xué)分析和基因挖掘技術(shù),從眾多微生物中找到了多種新型的BVMO;而利用蛋白質(zhì)工程技術(shù)對已知的野生型BVMO進行改造,可以改善酶的立體、區(qū)域和化學(xué)選擇性,擴大底物范圍,提高酶的熱穩(wěn)定性和反應(yīng)活性。隨著國內(nèi)外相關(guān)研究的進展,Baeyer-Villiger單加氧酶在有機合成中的應(yīng)用將進一步得到拓寬。本論文通過對CHMO以及PAMO的蛋白質(zhì)工程改造,以期提高其催化活性和選擇性;并分別用這些突變株催化α-酮酯的還原反應(yīng)以及硼有機化合物的氧化拆分反應(yīng),研究突變結(jié)構(gòu)對2種非天然反應(yīng)的催化活性和立體選擇性的影響。具體研究內(nèi)容和結(jié)果如下:首先,本論文根據(jù)CHMO催化Baeyer-Villiger氧化反應(yīng)的機理,提出了利用CHMO催化循環(huán)中黃素的還原態(tài)將α-酮酯還原為α-羥基酯的假設(shè),探討了CHMO催化α-酮酯還原的多功能性反應(yīng)。在選擇苯甲酰甲酸乙酯作為模型底物底物并控制多個反應(yīng)條件和多個對照實驗的情況下,最終驗證了CHMO的確具備相應(yīng)的還原能力。進一步選擇了CHMO活性中心附近的8個氨基酸殘基進行定向進化,通過篩選后獲得了具有優(yōu)異活性和R構(gòu)型立體選擇性的突變株L143F,其ee值為98%,還獲得了立體選擇性反轉(zhuǎn)的突變株F277L。繼而利用CHMOL143F突變株考察了全細(xì)胞狀態(tài)下,反應(yīng)溫度、誘導(dǎo)劑濃度、pH環(huán)境、沉淀菌株等條件對反應(yīng)的影響。最后,設(shè)計了8種拓展底物研究了該還原反應(yīng)的普適性和底物范圍。其次,本論文研究了PAMO催化α-苯乙基頻哪醇硼烷的非天然氧化拆分反應(yīng)。但在全細(xì)胞環(huán)境中,野生型PAMO的立體選擇性很差。定向進化研究發(fā)現(xiàn),PAMO的活性位點Loop上67以及440-446位點與底物的特異性以及空間選擇性有密切聯(lián)系。我們選用野生型PAMO為模板,在上述6個位置進行定向進化,構(gòu)建單突變文庫。通過篩選,最終發(fā)現(xiàn)I67Q突變株可將產(chǎn)物立體選擇性由野生型的25%(S)提高到72%(S),而S441E突變株實現(xiàn)了產(chǎn)物的優(yōu)勢構(gòu)型由S逆轉(zhuǎn)為及,產(chǎn)物的ee值為45%。考慮到硫醚類底物與模型底物的相似性,我們選擇以突變株4M(167Q/P440F/A442N/L443I)為模板,將 67、440、442、443位點突變?yōu)椴煌笮∫约安煌釅A性的氨基酸,進一步探索能實現(xiàn)更高尺構(gòu)型立體選擇性的突變株。最終發(fā)現(xiàn)構(gòu)成4M的4種單突變的產(chǎn)物優(yōu)勢構(gòu)型都是S構(gòu)型,而4M突變的優(yōu)勢產(chǎn)物為及構(gòu)型,進一步驗證了雜原子氧化反應(yīng)機理的相似性,但以4M為模板的其他突變并未獲得高立體選擇性的篩選結(jié)果。
【學(xué)位單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ426.97
【部分圖文】：

模型中無法分析輔因子的機制［１９１。為進一步提升同原模型的可用性和準(zhǔn)確性，逡逑２０１４邋年邋Ｐａｔｒｉｃｉａ邋等人基于來源于邋／？／？ｏｔ／ｏｃｏｃｃ７？邋ｓｐ．．ｓ７ｒａ／？／／／－＿？／邋的邋ＣＨＭ0Ｒｈ邋的晶體逡逑結(jié)構(gòu)（ＰＤＢｃｏｄｅ：４ＲＧ３）圖１－２，成功構(gòu)建出包含ＮＡＤＰＨ的ＣＨＭＯａ■丨。的新型逡逑同源模型，并使用多組實驗數(shù)據(jù)驗證其可靠性［２（）｜。雖然ＣＨＭＯＡｃｉｎｅｔ。的晶體結(jié)逡逑構(gòu)到目前還未解明，但由于ＣＨＭＯＲｈ與ＣＨＭＯＡｃｍｅｔ。在活性位點附近有非常高逡逑的同源性，２０１９年Ｗｕｑｉ等人也根據(jù)ＣＨＭＯａｈ的晶體結(jié)構(gòu)（ＰＤＢｃｏｄｅ：４ＲＧ３），逡逑構(gòu)建了邋ＣＨＭＯＡｃ，＿的同源模型［２１］。逡逑％逡逑圖１－２邋ＣＨＭＯＲｈ三維立體結(jié)構(gòu)（ＰＤＢ１Ｄ：４ＲＧ３）逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１－２邋Ｔｈｅ邋ｔｈｒｅｅ－ｄｉｍｅｎｓｉｏｎａｌ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ＣＨＭＯＲｈ邋（ＰＤＢ邋ＩＤ：邋４ＲＧ３）逡逑

圖２－４ｐＢＡＤ＿ＰＡＭＯ質(zhì)粒圖譜逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋２－４邋Ｐｈｙｓｉｃａｌ邋ｍａｐ邋ｏｆ邋ｐＢＡＤ邋ＰＡＭＯ邋ｐｌａｓｍｉｄ逡逑２．２．１．４實驗儀器逡逑

ＣＨＭＯ催化ａ－酮酯的非天然還原反應(yīng)逡逑圖３－１所示，野生型的ＣＨＭＯ的分子量大概是７０邋ｋＤａ，對應(yīng)Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｍａｒｋｅｒ的逡逑相應(yīng)條帶位置，ＣＨＭＯ的條帶清晰，無太多雜質(zhì)。逡逑\l．逡逑q咤澹罰板澹耄模徨濉義洗炕祝藻澹茫齲停襄義稀鰣義希停幔潁耄澹蟈義賢跡常幣吧停茫齲停系模櫻模櫻校粒牽拍旱纈就煎義希疲椋紓酰潁邋澹常卞澹校酰潁椋媯椋澹溴澹穡潁錚簦澹椋鑠澹錚駑澹鰨椋歟溴澹簦穡邋澹茫齲停襄澹幔睿幔歟澹溴澹猓澹櫻模櫻校粒牽佩義希常玻跺澹茫齲停洗呋幔サ幕乖從﹀義先赴低常哄義戲直鷓∮靡吧停茫齲停稀⑽拗柿４蟪Ω司攏蹋玻保模牛場⒋校穡牛裕玻玻猓ǎ┛趙劐義現(xiàn)柿＃ㄎ蓿茫齲

本文編號：2827255