發(fā)布時(shí)間：2020-09-24 10:32

【摘要】：堿性蛋白酶是一種在堿性pH范圍內(nèi),通過催化水解連接氨基酸的肽鍵來催化蛋白質(zhì)分解代謝的特殊蛋白質(zhì)。目前堿性蛋白酶廣泛用于生活的方方面面,包括洗滌劑制造,皮革加工,烘焙合成行業(yè),因此成為最主要研究的蛋白酶類型。堿性蛋白酶的性能受到多種因素(pH、離子強(qiáng)度、溫度和機(jī)械操作)的影響。具有優(yōu)良性能的堿性蛋白酶可以進(jìn)一步優(yōu)化工藝流程,因此總是處于需求狀態(tài)。對(duì)于工業(yè)應(yīng)用,堿性蛋白酶在比較不利的環(huán)境下也必須具有活性,因此蛋白酶需具有工藝適應(yīng)性和長期穩(wěn)定性。由于傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)的酶活性較低,再加上蛋白酶在環(huán)境條件極端改變時(shí),其結(jié)構(gòu)變得無序,酶活性降低甚至喪失,使得堿性蛋白酶的應(yīng)用受到了限制�？紤]到這一點(diǎn),堿性蛋白酶活性的激活劑成為蛋白酶制劑實(shí)際應(yīng)用中需要考慮的重要因素。研究表明Ca~(2+)是大多數(shù)蛋白酶的激活劑和穩(wěn)定劑,來提高酶的活性,結(jié)合在蛋白酶特定位點(diǎn)以保護(hù)酶的構(gòu)象。因此,本論文選取已知結(jié)構(gòu)的堿性蛋白酶PB92作為研究對(duì)象,其結(jié)構(gòu)中有兩個(gè)Ca~(2+)結(jié)合位點(diǎn),選擇氯化鈣和甲酸鈣來研究金屬鈣離子對(duì)堿性蛋白酶的作用。本文主要研究了氯化鈣和甲酸鈣對(duì)堿性蛋白酶PB92活性的影響,通過動(dòng)態(tài)光散射實(shí)驗(yàn)和相互作用的熒光光譜探討了二者相互作用的機(jī)理。第一,通過測(cè)定加入不同濃度的氯化鈣和甲酸鈣后,堿性蛋白酶PB92酶活力的變化,得到1 mmol/L到5 mmol/L濃度范圍內(nèi)的氯化鈣和甲酸鈣在溫度40℃、pH 10.5下對(duì)蛋白酶的酶活均有促進(jìn)作用,其中氯化鈣相對(duì)甲酸鈣對(duì)堿性蛋白酶PB92酶活的促進(jìn)作用更加明顯。第二,測(cè)定了加入不同濃度Ca~(2+)后,堿性蛋白酶PB92粒徑和蛋白酶溶液電位的變化。加入不同濃度Ca~(2+)后粒徑變化表明,Ca~(2+)的加入使得堿性蛋白酶PB92的平均粒徑減小,疏水結(jié)構(gòu)逐漸向蛋白酶內(nèi)部轉(zhuǎn)移,從而蛋白酶的結(jié)構(gòu)更為緊密,有利于蛋白酶酶活力的提高。加入不同濃度Ca~(2+)后蛋白酶溶液電位變化表明,隨著濃度逐漸增大Ca~(2+)所帶的正電荷使帶負(fù)電荷的堿性蛋白酶逐漸趨向于電中性,其結(jié)果是雙電層變薄,Zeta電位負(fù)值逐漸減小,消除了帶電基團(tuán)對(duì)酶的不利影響,有利于酶活力的保持。第三,研究了Ca~(2+)與堿性蛋白酶PB92結(jié)合后熒光強(qiáng)度的變化,發(fā)現(xiàn)Ca~(2+)對(duì)堿性蛋白酶PB92具有一定的猝滅作用。根據(jù)Stern-Volmer公式對(duì)其猝滅機(jī)理的探討,得到了Ca~(2+)與堿性蛋白酶PB92的結(jié)合位點(diǎn)數(shù)n=1.90,結(jié)合常數(shù)K_b=6.03×10~5 L/mol,確定了Ca~(2+)對(duì)堿性蛋白酶的猝滅機(jī)制為單一的靜態(tài)猝滅,且Ca~(2+)與堿性蛋白酶的結(jié)合能力很強(qiáng)。通過Ca~(2+)與堿性蛋白酶計(jì)算得到的熱力學(xué)參數(shù)分析可知Ca~(2+)與堿性蛋白酶通過靜電作用力形成穩(wěn)定的復(fù)合物,且結(jié)合過程能夠自發(fā)進(jìn)行。最后,研究了Ca~(2+)提高堿性蛋白酶催化活性在洗滌劑中的應(yīng)用。研究表明其他洗滌條件相同時(shí),添加蛋白酶的洗滌劑和添加加鈣蛋白酶的洗滌劑對(duì)國標(biāo)蛋白污布JB02和自制血漬污布的去污效果明顯高于未添加蛋白酶PB92及Ca~(2+)的洗滌劑。洗滌效果(好—差)排序均為:添加加鈣蛋白酶PB92的洗滌劑添加蛋白酶PB92的洗滌劑市售洗滌劑。通過光學(xué)顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),蛋白污布纖維表面和縫隙中的蛋白污漬被去除。尤其是在添加蛋白酶PB92的洗滌劑、添加加鈣蛋白酶PB92的洗滌劑中洗滌后,污布單根纖維表面變得光滑明亮,并且纖維排列也較整齊分明。由洗滌前后ATR-FTIR圖變化可知,Ca~(2+)與堿性蛋白酶PB92協(xié)同作用于國標(biāo)污布JB02和血漬污布的污漬,針對(duì)性的催化水解連接氨基酸的肽鍵來催化國標(biāo)污布JB02污漬和血漬中的蛋白質(zhì)分解代謝,相較使用不添加Ca~(2+)和堿性蛋白酶PB92的洗滌劑進(jìn)行洗滌,去污效果得到改善,洗滌效果有一個(gè)顯著性的提高。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ649.1
【圖文】：

引言動(dòng)植物和微生物都可以生產(chǎn)堿性蛋白酶，微生物（主要是芽孢桿菌等）生白酶的優(yōu)越性表現(xiàn)在微生物可以在適宜條件下大量培養(yǎng)[1]。堿性蛋白酶是pH范圍內(nèi)，通過催化水解連接氨基酸的肽鍵來催化蛋白質(zhì)分解代謝的特殊目前堿性蛋白酶廣泛用于生活的方方面面，包括洗滌劑制造，皮革加工行業(yè)，因此成為最主要研究的蛋白酶類型。堿性蛋白酶 堿性蛋白酶的結(jié)構(gòu)層次堿性蛋白酶可以催化水解連接氨基酸的肽鍵來催化蛋白質(zhì)分解代謝。蛋白尤其是空間構(gòu)象的穩(wěn)定性對(duì)于蛋白酶的催化作用來說是不可或缺的[3-5]。堿性蛋白酶的一級(jí)結(jié)構(gòu)如圖 1.1 所示，基因 DNA 序列的改變可能導(dǎo)致堿基酸序列的改變，而即使只改變堿性蛋白酶序列中的一個(gè)氨基酸，也會(huì)影白酶的整體結(jié)構(gòu)和功能。

圖 1.2 堿性蛋白酶的二級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1.2 Secondary alkaline protease structure多肽的整體三維結(jié)構(gòu)為堿性蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)，主要是由于構(gòu)成蛋白酶的的相互作用[7]，如圖 1.3 所示。有助于三級(jí)結(jié)構(gòu)的 R 基團(tuán)相互作用包括氫鍵、偶極間相互作用、倫敦力（色散力）以及整個(gè)范圍內(nèi)存在的共價(jià)鍵。如電荷的 R 基團(tuán)相互排斥，而具有相反電荷的 R 基團(tuán)可以形成離子鍵[8]。另互作用對(duì)三級(jí)結(jié)構(gòu)也至關(guān)重要，具有非極性疏水性 R 基團(tuán)的氨基酸在蛋白聚集在一起，在外部留下親水性氨基酸以與周圍的水分子相互作用[9]。最特殊類型的共價(jià)鍵可以促成三級(jí)結(jié)構(gòu)：二硫鍵。二硫鍵是半胱氨酸的含硫的共價(jià)鍵，比其他類型的有助于三級(jí)結(jié)構(gòu)的鍵強(qiáng)得多[10]。它們像分子“安一樣起作用，使多肽的部分牢固地相互連接。

圖 1.3 堿性蛋白酶的三級(jí)結(jié)構(gòu)Fig.1.3 Tertiary alkaline protease structure堿性蛋白酶由多個(gè)多肽鏈組成，也稱為亞基。亞基的種類、數(shù)目、空間結(jié)基間的相互作用形成堿性蛋白酶的四級(jí)結(jié)構(gòu)[11]，如圖 1.4 所示。

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本文編號(hào)：2825621