血管內(nèi)皮生長因子(Vascular Endothelial Growth Factor,VEGF)是在細(xì)胞內(nèi)調(diào)節(jié)血管生成的一種重要因子,其在腫瘤組織中高水平表達(dá)。腫瘤血管是腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵性因素,如果切斷腫瘤血管對腫瘤的營養(yǎng)供給,原發(fā)性腫瘤的生長不會超過2mm,腫瘤轉(zhuǎn)移也將無法實(shí)現(xiàn)。因此,阻斷VEGF的作用,已經(jīng)成為腫瘤治療中的一個研究熱點(diǎn)。貝伐單抗(Bevacizumab)是針對VEGF靶點(diǎn)的人源化的一種單克隆抗體,它可以與VEGF發(fā)生特異性結(jié)合,而抑制下游信號通路,使VEGF失去生物活性,達(dá)到抑制腫瘤血管生長的作用�；谄淞己玫寞熜Ш团R床需求的不斷提高,在全球范圍內(nèi)掀起了貝伐單抗生物仿制藥研發(fā)的熱潮。在單抗類生物仿制藥的研發(fā)生產(chǎn)中,候選藥與原研藥的相似性評價要貫穿始終,其中生物學(xué)活性是生物仿制藥的關(guān)鍵質(zhì)量屬性之一,在研發(fā)生產(chǎn)中,應(yīng)建立一套穩(wěn)定、可靠的生物學(xué)活性檢測方法,對生物仿制藥進(jìn)行質(zhì)量控制。本研究的目的是在貝伐單抗仿制藥的研發(fā)生產(chǎn)中建立其生物活性的檢測方法。此研究中,我們應(yīng)用人臍靜脈上皮細(xì)胞(Human Umbilical Vein Endothelial Cells,HUVEC)增殖抑制法和表面等離子共振技術(shù)(Surface Plasmon Resonance,SPR)法進(jìn)行生物活性檢測方法的開發(fā),需要優(yōu)化的實(shí)驗(yàn)條件包括:VEGF的最佳濃度、樣品的最佳起始濃度、稀釋倍數(shù)、稀釋梯度以及配體和分析物的濃度。檢測方法經(jīng)過驗(yàn)證后符合方法學(xué)的驗(yàn)證標(biāo)準(zhǔn),并應(yīng)用該方法對候選藥樣品進(jìn)行生物活性的檢測。研究結(jié)果如下:1.在基于HUVEC增殖抑制法活性方法的開發(fā)實(shí)驗(yàn)中,確定VEGF的最適作用濃度為30 ng/m L,樣品起始濃度是3μg/mL,稀釋倍數(shù)為3倍,稀釋梯度定為8個梯度;經(jīng)過驗(yàn)證,該實(shí)驗(yàn)方法專屬性較強(qiáng),僅在貝伐單抗生物仿制藥中呈現(xiàn)相應(yīng)的劑量關(guān)系曲線,連續(xù)6次實(shí)驗(yàn)線性結(jié)果的R~2值均在97%以上;重復(fù)性6次實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品的EC_(50)0 RSD%25%;準(zhǔn)確性和中間精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果樣品的Specific activity的值均在70%~130%之間。2.在基于表面等離子共振技術(shù)(SPR)活性方法的開發(fā)實(shí)驗(yàn)中,確定配體濃度0.5μg/mL,分析物濃度2.3μg/mL為最佳實(shí)驗(yàn)條件。3.在貝伐單抗生物仿制藥樣品制備工藝中,通過對培養(yǎng)溫度、pH值、轉(zhuǎn)速等試驗(yàn)條件進(jìn)行優(yōu)化,最終確定培養(yǎng)溫度為37℃、pH值為7.1、初始轉(zhuǎn)速200 rpm,第七天調(diào)到300 rpm為最佳細(xì)胞培養(yǎng)條件。4.應(yīng)用HUVEC增殖抑制法對貝伐單抗仿制藥的發(fā)酵工藝產(chǎn)品進(jìn)行活性檢測,其候選藥的Specific activity的值為98.47%。同時按照以上基于SPR技術(shù)建立的活性檢測方法對該候選藥進(jìn)行檢測,得到其結(jié)合速率常數(shù)ka(1/Ms)值為8.46E+05,解離速率常數(shù)kd(1/s)值為1.61E-04,親和力KD值為1.90E-10。結(jié)果表明,基于HUVEC增殖抑制法開發(fā)的活性檢測方法專屬性強(qiáng),線性及重復(fù)性好,準(zhǔn)確性及中間精密度高;在基于表面等離子共振技術(shù)活性方法開發(fā)實(shí)驗(yàn)中,標(biāo)準(zhǔn)品和候選藥樣品的親和力值極為接近,動力學(xué)曲線幾乎相同,兩種方法都可用于貝伐單抗生物仿制藥生物活性的檢測,具有潛在的臨床參考價值。
【學(xué)位單位】：黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ460.7;TQ920.6
【部分圖文】：

圖 3.1 HUVEC 細(xì)胞計(jì)數(shù)結(jié)果Fig. 3.1 The count of HUVEC cellsC 細(xì)胞庫無菌檢測按照中國藥典（2015 版）要求，對 HUVEC 檢測用細(xì)胞庫進(jìn)

圖 3.2 HUVEC 細(xì)胞庫支原體檢測Fig. 3.2 Detection of mycoplasma in HUVEC cell bankM：DNAmarker；1，2：陰性對照；3，4，8，12，16：陽性對5，6，7：細(xì)胞庫-F1；9，10，11：細(xì)胞庫-F2；13，14，15：細(xì)胞GF 最適作用濃度優(yōu)化

圖 3.3 VEGF 刺激 HUVEC 細(xì)胞增殖曲ose-response curve of VEGF stimulate HUVEC p、稀釋倍數(shù)、梯度的優(yōu)化品最適起始濃度，最佳稀釋倍數(shù)及稀釋梯度等

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 吳久鴻;李洪;;仿制藥在美國和印度的生產(chǎn)及使用情況對中國的啟示[J];中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué);2018年07期

2 陳昊;;仿制藥的春天還有多遠(yuǎn)[J];中國衛(wèi)生;2018年05期

3 ;推進(jìn)仿制藥一致性評價提升行業(yè)發(fā)展水平——仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價有關(guān)政策解讀[J];中國藥物評價;2016年05期

4 陳燕忠;;仿制藥一致性評價——機(jī)遇與挑戰(zhàn)[J];藥學(xué)進(jìn)展;2016年12期

5 ;仿制藥質(zhì)量和療效一致性評價政策問答[J];中國食品藥品監(jiān)管;2016年12期

6 韓軍;;加快仿制藥一致性評價步伐,推進(jìn)醫(yī)藥產(chǎn)業(yè)供給側(cè)結(jié)構(gòu)性改革[J];藥學(xué)進(jìn)展;2017年03期

7 張煊;;仿制藥一致性評價意義深遠(yuǎn)[J];中國衛(wèi)生;2017年05期

8 向金蓮;;開展仿制藥質(zhì)量一致性評價的現(xiàn)狀和意義[J];中國藥物經(jīng)濟(jì)學(xué);2017年07期

9 陳少羽;馮毅;;歐盟仿制藥審批與監(jiān)管簡介[J];中國新藥雜志;2016年01期

10 陳少羽;馮毅;;日本仿制藥審批與監(jiān)管簡介[J];中國新藥雜志;2016年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 盛曉霞;;“一致性評價”下的仿制藥開發(fā)戰(zhàn)略[A];中國晶體學(xué)會第六屆學(xué)術(shù)年會暨會員代表大會（第六屆全國晶型藥物研發(fā)技術(shù)學(xué)術(shù)研討會）論文摘要集[C];2016年

2 劉海靜;曹茂開;宋愿智;;對“仿制藥一致性評價工作”的幾點(diǎn)認(rèn)識和思考[A];中國藥學(xué)會第三屆藥物檢測質(zhì)量管理學(xué)術(shù)研討會資料匯編[C];2016年

3 王佑富;王e

本文編號：2822563