珠子參[Panax japonicus]為五加科人參屬植物,是我國名貴常用中藥材,具有祛瘀生新、消炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和止血等多種功效。珠子參皂苷為珠子參的主要活性成分,包括達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型皂苷。目前,珠子參藥材多為野生品,其生長周期長,一般生長6年以上方能入藥。隨著市場需求的不斷增長,導(dǎo)致珠子參供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。對于高價值、低產(chǎn)量的天然藥物,為解決藥材資源問題,有必要運用現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)對珠子參皂苷的生物合成途徑進行探究,進而開展珠子參皂苷的合成生物學(xué)研究。珠子參三萜皂苷是珠子參的主要活性成分,與只含有達(dá)瑪烷型皂苷的同屬藥材“三七”相比,珠子參中不僅具有達(dá)瑪烷型皂苷,還含有三七中沒有的齊墩果烷型皂苷,因此珠子參的臨床用途與三七明顯不同。珠子參皂苷主要由甲羥戊酸(MVA)途徑合成,在該途徑中,達(dá)瑪烯二醇合成酶(DS)是達(dá)瑪烷型皂苷合成支路的關(guān)鍵酶,β-香樹脂醇合成酶(β-AS)是齊墩果烷型皂苷合成支路的關(guān)鍵酶,而2,3-氧化鯊烯為DS和β-AS的共同前體物質(zhì)。同時,2,3-氧化鯊烯也是珠子參皂苷合成途徑中副產(chǎn)物植物甾醇合成支路的前體物質(zhì),它經(jīng)過環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)的催化生成環(huán)阿屯醇,并經(jīng)一系列酶反應(yīng)過程合成植物甾醇。因此,環(huán)阿屯醇合成酶與珠子參皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶DS和β-AS之間存在競爭性消耗2,3-氧化鯊烯的關(guān)系。本研究采用RNAi技術(shù)使珠子參CAS基因(PjCAS)表達(dá)下調(diào),弱化植物甾醇的合成,使代謝流可以更多的流向三萜皂苷合成途徑,最終實現(xiàn)提高珠子參皂苷生物合成的目的。本論文通過反轉(zhuǎn)錄PCR將提取的珠子參總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以此為模板擴增出PjCAS基因RNAi片段,之后設(shè)計帶有attB位點的引物進行PCR擴增,得到兩端帶有attB重組位點的RNAi片段。隨后,利用Gateway~(TM)技術(shù)將帶有attB位點的RNAi片段通過BP反應(yīng)以同源重組的方式克隆到雙元表達(dá)載體pHellsgate 2上,完成RNAi表達(dá)載體pHellsgate-CAS的構(gòu)建。采用凍融法,將成功構(gòu)建的重組載體pHellsgate-CAS導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105,通過根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo),將外源基因成功導(dǎo)入并整合到珠子參基因組DNA中,經(jīng)含卡那霉素培養(yǎng)基和抗性基因PCR篩選,獲得6株P(guān)jCAS基因的RNAi轉(zhuǎn)基因陽性珠子參細(xì)胞系。熒光定量PCR檢測發(fā)現(xiàn),與普通珠子參細(xì)胞系(WT)相比,PjCAS RNAi細(xì)胞中,PjCAS基因的表達(dá)量明顯下調(diào),證明RNAi細(xì)胞系成功構(gòu)建。為了明確PjCAS基因在珠子參皂苷生物合成途徑中的作用,對6株轉(zhuǎn)基因陽性細(xì)胞系進行珠子參總皂苷以及植物甾醇含量的檢測,結(jié)果表明PjCAS基因發(fā)生RNAi的細(xì)胞系中植物甾醇含量較普通珠子參細(xì)胞明顯降低,而總皂苷含量則高于普通珠子參細(xì)胞系,說明PjCAS基因的RNAi能夠間接參與調(diào)控珠子參皂苷的代謝流。采用高效液相色譜法對珠子參中6中重要的單體皂苷——人參皂苷Rd、Rb1、Re、R0和竹節(jié)參皂苷IV、IVa進行檢測,各單體皂苷含量均有不同程度升高。為了初步明確皂苷增加的機理,檢測了珠子參皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因PjDS和PjAS的表達(dá)情況,證明PjDS和PjAS的表達(dá)量在PjCAS基因RNAi細(xì)胞系中均有所提高,說明PjCAS基因表達(dá)的下降,減少了甾醇合成支路的代謝流,從而可能間接增加了皂苷合成支路的流量,珠子參皂苷合成的兩條支路為了催化處理增加的代謝流,使得PjDS和PjAS基因的表達(dá)被動提高,進而增加了珠子參皂苷的合成量。以上研究表明,PjCAS基因?qū)χ樽訁⑷圃碥蘸铣赏緩桨l(fā)揮著重要調(diào)控作用,PjCAS基因表達(dá)的下調(diào)可間接增加了皂苷合成代謝流,促進了珠子參皂苷的生物合成。
【學(xué)位單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類】：TQ461
【部分圖文】：

第一章研究背景及意義3表1.1珠子參皂苷中的重要三萜皂苷Table1.1TheimportanttriterpenoidsaponinsinP.japonicus圖1.1珠子參中20(R)、20(S)-原人參二醇型皂苷類化合物結(jié)構(gòu)母核(A：20(R)-原人參二醇型皂苷；B：20(S)-原人參二醇型皂苷)Fig.1.1Skeletonsof20(R)and20(S)-protopanaxadiol(PPD)typeandtheirglycosidesinP.japonicus單體皂苷取代基母核類型Rb1R1=-Oglc2-1glc,R2=-Oglc6-1glc20(S)-原人參二醇RdR2=-Oglc2-1glc,R2=-Oglc20(S)-原人參二醇ReR1=-OH,R2=-Oglc,R3=-Oglc2-1rha20(S)-原人參三醇ⅠⅤR1=R2=R4=H,R3=ara(f),R5=glc齊墩果烷型BⅠⅤaR1=R2=R3=R4=H,R5=glc齊墩果烷型BR0R1=-glc2-1glc,R2=-glc齊墩果烷型A

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1.2珠子參中20(S)-原人參三醇型皂苷類化合物結(jié)構(gòu)母核（A:20(R)-protopanaxadiol(PPD)saponins;B：20(S)-protopanaxatriol(PPD)saponins）Fig.1.2Skeletonsof20(S)-protopanaxatriol(PPT)andtheirglycosidesinP.japonicus圖1.3珠子參中的齊墩果烷型三萜及其皂苷類化合物結(jié)構(gòu)母核（A：齊墩果烷型皂苷母核類型A；B：齊墩果烷型皂苷母核類型B）Fig.1.3Skeletonsofoleanane-typetriterpenesandtheirglycosidesinP.japonicus(A:Skeletonsofoleanane-typetriterpenesA；B：Skeletonsofoleanane-typetriterpenesB)在藥用植物中，珠子參以及其他人參屬植物如人參、三七、西洋參，都屬于世界上銷量較高的藥材，尤其以人參最受歡迎�！癙anax”一詞源于希臘語“Panacea”，意為治愈所有人。目前，人參屬的物種包括12種，珠子參是其中之

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1.2珠子參中20(S)-原人參三醇型皂苷類化合物結(jié)構(gòu)母核（A:20(R)-protopanaxadiol(PPD)saponins;B：20(S)-protopanaxatriol(PPD)saponins）Fig.1.2Skeletonsof20(S)-protopanaxatriol(PPT)andtheirglycosidesinP.japonicus圖1.3珠子參中的齊墩果烷型三萜及其皂苷類化合物結(jié)構(gòu)母核（A：齊墩果烷型皂苷母核類型A；B：齊墩果烷型皂苷母核類型B）Fig.1.3Skeletonsofoleanane-typetriterpenesandtheirglycosidesinP.japonicus(A:Skeletonsofoleanane-typetriterpenesA；B：Skeletonsofoleanane-typetriterpenesB)在藥用植物中，珠子參以及其他人參屬植物如人參、三七、西洋參，都屬于世界上銷量較高的藥材，尤其以人參最受歡迎。“Panax”一詞源于希臘語“Panacea”，意為治愈所有人。目前，人參屬的物種包括12種，珠子參是其中之

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本文編號：2822093