珠子參[Panax japonicus]為五加科人參屬植物,是我國(guó)名貴常用中藥材,具有祛瘀生新、消炎鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)和止血等多種功效。珠子參皂苷為珠子參的主要活性成分,包括達(dá)瑪烷型和齊墩果烷型皂苷。目前,珠子參藥材多為野生品,其生長(zhǎng)周期長(zhǎng),一般生長(zhǎng)6年以上方能入藥。隨著市場(chǎng)需求的不斷增長(zhǎng),導(dǎo)致珠子參供不應(yīng)求的現(xiàn)狀。對(duì)于高價(jià)值、低產(chǎn)量的天然藥物,為解決藥材資源問(wèn)題,有必要運(yùn)用現(xiàn)代分子生物學(xué)及基因工程技術(shù)對(duì)珠子參皂苷的生物合成途徑進(jìn)行探究,進(jìn)而開(kāi)展珠子參皂苷的合成生物學(xué)研究。珠子參三萜皂苷是珠子參的主要活性成分,與只含有達(dá)瑪烷型皂苷的同屬藥材“三七”相比,珠子參中不僅具有達(dá)瑪烷型皂苷,還含有三七中沒(méi)有的齊墩果烷型皂苷,因此珠子參的臨床用途與三七明顯不同。珠子參皂苷主要由甲羥戊酸(MVA)途徑合成,在該途徑中,達(dá)瑪烯二醇合成酶(DS)是達(dá)瑪烷型皂苷合成支路的關(guān)鍵酶,β-香樹(shù)脂醇合成酶(β-AS)是齊墩果烷型皂苷合成支路的關(guān)鍵酶,而2,3-氧化鯊烯為DS和β-AS的共同前體物質(zhì)。同時(shí),2,3-氧化鯊烯也是珠子參皂苷合成途徑中副產(chǎn)物植物甾醇合成支路的前體物質(zhì),它經(jīng)過(guò)環(huán)阿屯醇合成酶(CAS)的催化生成環(huán)阿屯醇,并經(jīng)一系列酶反應(yīng)過(guò)程合成植物甾醇。因此,環(huán)阿屯醇合成酶與珠子參皂苷合成途徑中的關(guān)鍵酶DS和β-AS之間存在競(jìng)爭(zhēng)性消耗2,3-氧化鯊烯的關(guān)系。本研究采用RNAi技術(shù)使珠子參CAS基因(PjCAS)表達(dá)下調(diào),弱化植物甾醇的合成,使代謝流可以更多的流向三萜皂苷合成途徑,最終實(shí)現(xiàn)提高珠子參皂苷生物合成的目的。本論文通過(guò)反轉(zhuǎn)錄PCR將提取的珠子參總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA,并以此為模板擴(kuò)增出PjCAS基因RNAi片段,之后設(shè)計(jì)帶有attB位點(diǎn)的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,得到兩端帶有attB重組位點(diǎn)的RNAi片段。隨后,利用Gateway~(TM)技術(shù)將帶有attB位點(diǎn)的RNAi片段通過(guò)BP反應(yīng)以同源重組的方式克隆到雙元表達(dá)載體pHellsgate 2上,完成RNAi表達(dá)載體pHellsgate-CAS的構(gòu)建。采用凍融法,將成功構(gòu)建的重組載體pHellsgate-CAS導(dǎo)入農(nóng)桿菌EHA105,通過(guò)根癌農(nóng)桿菌的介導(dǎo),將外源基因成功導(dǎo)入并整合到珠子參基因組DNA中,經(jīng)含卡那霉素培養(yǎng)基和抗性基因PCR篩選,獲得6株P(guān)jCAS基因的RNAi轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性珠子參細(xì)胞系。熒光定量PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn),與普通珠子參細(xì)胞系(WT)相比,PjCAS RNAi細(xì)胞中,PjCAS基因的表達(dá)量明顯下調(diào),證明RNAi細(xì)胞系成功構(gòu)建。為了明確PjCAS基因在珠子參皂苷生物合成途徑中的作用,對(duì)6株轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性細(xì)胞系進(jìn)行珠子參總皂苷以及植物甾醇含量的檢測(cè),結(jié)果表明PjCAS基因發(fā)生RNAi的細(xì)胞系中植物甾醇含量較普通珠子參細(xì)胞明顯降低,而總皂苷含量則高于普通珠子參細(xì)胞系,說(shuō)明PjCAS基因的RNAi能夠間接參與調(diào)控珠子參皂苷的代謝流。采用高效液相色譜法對(duì)珠子參中6中重要的單體皂苷——人參皂苷Rd、Rb1、Re、R0和竹節(jié)參皂苷IV、IVa進(jìn)行檢測(cè),各單體皂苷含量均有不同程度升高。為了初步明確皂苷增加的機(jī)理,檢測(cè)了珠子參皂苷生物合成途徑中的關(guān)鍵酶基因PjDS和PjAS的表達(dá)情況,證明PjDS和PjAS的表達(dá)量在PjCAS基因RNAi細(xì)胞系中均有所提高,說(shuō)明PjCAS基因表達(dá)的下降,減少了甾醇合成支路的代謝流,從而可能間接增加了皂苷合成支路的流量,珠子參皂苷合成的兩條支路為了催化處理增加的代謝流,使得PjDS和PjAS基因的表達(dá)被動(dòng)提高,進(jìn)而增加了珠子參皂苷的合成量。以上研究表明,PjCAS基因?qū)χ樽訁⑷圃碥蘸铣赏緩桨l(fā)揮著重要調(diào)控作用,PjCAS基因表達(dá)的下調(diào)可間接增加了皂苷合成代謝流,促進(jìn)了珠子參皂苷的生物合成。
【學(xué)位單位】：昆明理工大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2019
【中圖分類(lèi)】：TQ461
【部分圖文】：

第一章研究背景及意義3表1.1珠子參皂苷中的重要三萜皂苷Table1.1TheimportanttriterpenoidsaponinsinP.japonicus圖1.1珠子參中20(R)、20(S)-原人參二醇型皂苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)母核(A：20(R)-原人參二醇型皂苷；B：20(S)-原人參二醇型皂苷)Fig.1.1Skeletonsof20(R)and20(S)-protopanaxadiol(PPD)typeandtheirglycosidesinP.japonicus單體皂苷取代基母核類(lèi)型Rb1R1=-Oglc2-1glc,R2=-Oglc6-1glc20(S)-原人參二醇RdR2=-Oglc2-1glc,R2=-Oglc20(S)-原人參二醇ReR1=-OH,R2=-Oglc,R3=-Oglc2-1rha20(S)-原人參三醇ⅠⅤR1=R2=R4=H,R3=ara(f),R5=glc齊墩果烷型BⅠⅤaR1=R2=R3=R4=H,R5=glc齊墩果烷型BR0R1=-glc2-1glc,R2=-glc齊墩果烷型A

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1.2珠子參中20(S)-原人參三醇型皂苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)母核（A:20(R)-protopanaxadiol(PPD)saponins;B：20(S)-protopanaxatriol(PPD)saponins）Fig.1.2Skeletonsof20(S)-protopanaxatriol(PPT)andtheirglycosidesinP.japonicus圖1.3珠子參中的齊墩果烷型三萜及其皂苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)母核（A：齊墩果烷型皂苷母核類(lèi)型A；B：齊墩果烷型皂苷母核類(lèi)型B）Fig.1.3Skeletonsofoleanane-typetriterpenesandtheirglycosidesinP.japonicus(A:Skeletonsofoleanane-typetriterpenesA；B：Skeletonsofoleanane-typetriterpenesB)在藥用植物中，珠子參以及其他人參屬植物如人參、三七、西洋參，都屬于世界上銷(xiāo)量較高的藥材，尤其以人參最受歡迎�！癙anax”一詞源于希臘語(yǔ)“Panacea”，意為治愈所有人。目前，人參屬的物種包括12種，珠子參是其中之

昆明理工大學(xué)碩士學(xué)位論文4圖1.2珠子參中20(S)-原人參三醇型皂苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)母核（A:20(R)-protopanaxadiol(PPD)saponins;B：20(S)-protopanaxatriol(PPD)saponins）Fig.1.2Skeletonsof20(S)-protopanaxatriol(PPT)andtheirglycosidesinP.japonicus圖1.3珠子參中的齊墩果烷型三萜及其皂苷類(lèi)化合物結(jié)構(gòu)母核（A：齊墩果烷型皂苷母核類(lèi)型A；B：齊墩果烷型皂苷母核類(lèi)型B）Fig.1.3Skeletonsofoleanane-typetriterpenesandtheirglycosidesinP.japonicus(A:Skeletonsofoleanane-typetriterpenesA；B：Skeletonsofoleanane-typetriterpenesB)在藥用植物中，珠子參以及其他人參屬植物如人參、三七、西洋參，都屬于世界上銷(xiāo)量較高的藥材，尤其以人參最受歡迎�！癙anax”一詞源于希臘語(yǔ)“Panacea”，意為治愈所有人。目前，人參屬的物種包括12種，珠子參是其中之

【相似文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 高金金;李潞洋;;基于CAS的服務(wù)器虛擬化在高校實(shí)驗(yàn)室的應(yīng)用[J];山西電子技術(shù);2016年06期

2 曹亞強(qiáng);胡寧;沈湛;;徐州市縣CAS區(qū)域控制的設(shè)計(jì)與實(shí)現(xiàn)[J];中國(guó)有線電視;2017年07期

3 劉偉;李智超;;基于CAS理論的高校學(xué)生管理模式研究[J];山西農(nóng)經(jīng);2017年13期

4 華培凱;白冰;;企業(yè)財(cái)務(wù)能力系統(tǒng)復(fù)雜適應(yīng)性分析——基于CAS理論[J];財(cái)會(huì)通訊;2016年04期

5 張利斌;涂慧;;基于CAS理論的大學(xué)課堂教學(xué)[J];綠色科技;2016年09期

6 羅迪江;;基于CAS的語(yǔ)言遷移的生成過(guò)程探析[J];外國(guó)語(yǔ)文;2013年05期

7 張琳玲;可星;劉釗;;基于CAS理論的企業(yè)創(chuàng)新系統(tǒng)涌現(xiàn)機(jī)理探析[J];中國(guó)商貿(mào);2013年22期

8 宋立強(qiáng);薛惠鋒;趙小平;;基于CAS理論的城市綠地系統(tǒng)初步研究[J];黑龍江史志;2013年15期

9 林玲玲;;基于CAS理論的無(wú)水港物流網(wǎng)絡(luò)研究[J];商業(yè)文化(下半月);2012年06期

10 陳明紅;;基于CAS理論的網(wǎng)絡(luò)信息生態(tài)系統(tǒng)分析[J];情報(bào)科學(xué);2012年07期

相關(guān)會(huì)議論文 前10條

1 張利斌;鐘復(fù)平;張鵬程;;基于CAS視角的領(lǐng)導(dǎo)理論[A];第八屆中國(guó)軟科學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文集(上)[C];2011年

2 李晨光;;基于CAS的技術(shù)預(yù)見(jiàn)對(duì)高新技術(shù)企業(yè)自主創(chuàng)新的影響[A];第五屆全國(guó)技術(shù)預(yù)見(jiàn)學(xué)術(shù)交流會(huì)暨全國(guó)技術(shù)預(yù)見(jiàn)與科技規(guī)劃理論與實(shí)踐研討會(huì)會(huì)議論文集[C];2009年

3 馮克鵬;田軍倉(cāng);;基于CAS理論的水資源優(yōu)化配置系統(tǒng)分析和認(rèn)識(shí)[A];2012全國(guó)水資源合理配置與優(yōu)化調(diào)度技術(shù)專(zhuān)刊[C];2012年

4 張利斌;朱乾宇;;企業(yè)核心剛性進(jìn)化機(jī)制研究:基于CAS視角[A];第25屆中國(guó)控制會(huì)議論文集（上冊(cè)）[C];2006年

5 張立榮;方X;;公共危機(jī)與政府治理模式變革——以復(fù)雜適應(yīng)系統(tǒng)理論(CAS)為研究視角[A];“構(gòu)建和諧社會(huì)與深化行政管理體制改革”研討會(huì)暨中國(guó)行政管理學(xué)會(huì)2007年年會(huì)論文集[C];2007年

6 張利斌;朱乾宇;;企業(yè)核心剛性和創(chuàng)新績(jī)效相關(guān)性研究:基于CAS視角[A];第25屆中國(guó)控制會(huì)議論文集（上冊(cè)）[C];2006年

7 田建國(guó);;CAS終點(diǎn)鋼水溫度預(yù)測(cè)模型[A];冶金軋制過(guò)程自動(dòng)化技術(shù)交流會(huì)論文集[C];2005年

8 張進(jìn)輔;朱韶蓁;;大學(xué)生適應(yīng)性量表(CAS)的修訂[A];第十一屆全國(guó)心理學(xué)學(xué)術(shù)會(huì)議論文摘要集[C];2007年

9 李敬偉;徐運(yùn);;頸動(dòng)脈狹窄支架成形術(shù)(CAS)的并發(fā)癥及處理[A];第九次全國(guó)神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)大會(huì)論文匯編[C];2006年

10 彭飛;梁開(kāi)明;胡安民;邵華;;以黃金尾礦為原料制備的CAS系統(tǒng)微晶玻璃的形核析晶動(dòng)力學(xué)研究[A];第十三屆全國(guó)高技術(shù)陶瓷學(xué)術(shù)年會(huì)摘要集[C];2004年

相關(guān)重要報(bào)紙文章 前1條

1 本報(bào)記者 慕欣;治療頸動(dòng)脈狹窄：CEA和CAS,如何選擇[N];醫(yī)藥經(jīng)濟(jì)報(bào);2010年

相關(guān)博士學(xué)位論文 前10條

1 王偉;轉(zhuǎn)型期中國(guó)生態(tài)安全與治理：基于CAS理論視角的經(jīng)濟(jì)學(xué)分析框架[D];西南財(cái)經(jīng)大學(xué);2012年

2 楊旭輝;基于CAS的地方政府固定資產(chǎn)投資系統(tǒng)研究[D];北京交通大學(xué);2015年

3 徐美鳳;基于CAS的學(xué)術(shù)虛擬社區(qū)知識(shí)共享研究[D];南京大學(xué);2011年

4 喬利軍;基于CAS的腦卒中高危因素者證候要素與頸動(dòng)脈超聲的研究[D];廣州中醫(yī)藥大學(xué);2014年

5 張保林;基于CAS的產(chǎn)業(yè)集群形成[D];江西財(cái)經(jīng)大學(xué);2011年

6 呂榮杰;基于CAS理論的公司治理系統(tǒng)研究[D];河北工業(yè)大學(xué);2008年

7 付韜;基于CAS的焦點(diǎn)企業(yè)核型集群創(chuàng)新網(wǎng)絡(luò)演化機(jī)理研究[D];北京工業(yè)大學(xué);2011年

8 段旭輝;基于CAS理論的大學(xué)生自主創(chuàng)業(yè)支持體系研究[D];中國(guó)地質(zhì)大學(xué);2015年

9 宋楊;基于CAS理論的第四方物流系統(tǒng)關(guān)鍵運(yùn)作機(jī)制研究[D];東北林業(yè)大學(xué);2010年

10 陳俊智;基于CAS理論的區(qū)域性礦山復(fù)雜采選系統(tǒng)匹配研究及應(yīng)用[D];昆明理工大學(xué);2009年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 姜森;由RNAi介導(dǎo)的CAS基因沉默對(duì)珠子參皂苷合成的影響[D];昆明理工大學(xué);2019年

2 胡永濤;CAS單點(diǎn)登錄技術(shù)在屏屏通系統(tǒng)中的應(yīng)用[D];北京工業(yè)大學(xué);2019年

3 張向陽(yáng);基于CAS的統(tǒng)一認(rèn)證及門(mén)戶管理在鐵路企業(yè)的研究與應(yīng)用[D];中國(guó)鐵道科學(xué)研究院;2018年

4 牛學(xué)奎;磷石膏分解過(guò)程中CaS產(chǎn)生及轉(zhuǎn)化機(jī)理研究[D];昆明理工大學(xué);2011年

5 張萌;CAS在企業(yè)信息資源整合中的應(yīng)用研究[D];大連海事大學(xué);2011年

6 楊昕;基于CAS理論的我國(guó)礦產(chǎn)資源儲(chǔ)量評(píng)審管理研究[D];中國(guó)地質(zhì)大學(xué)（北京）;2010年

7 彭建強(qiáng);基于CAS理論的企業(yè)物流系統(tǒng)建模與仿真研究[D];河北工業(yè)大學(xué);2007年

8 陳小燕;基于CAS理論的企業(yè)與環(huán)境協(xié)同進(jìn)化研究[D];河北工業(yè)大學(xué);2006年

9 孫雪;平貝母CAS基因干擾載體的構(gòu)建及遺傳轉(zhuǎn)化體系的建立[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2014年

10 左陽(yáng);基于CAS理論的森林保險(xiǎn)參與主體行為研究[D];北京林業(yè)大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2822093