番茄紅素(C_(40)H_(56))具有猝滅單線態(tài)氧、清除自由基、抑制脂質(zhì)過(guò)氧化等多種生理功能,廣泛應(yīng)用于醫(yī)療保健領(lǐng)域。與大多數(shù)萜類相似,番茄紅素在植物中的含量低,化學(xué)合成收率不高。合成生物技術(shù)的快速發(fā)展已經(jīng)實(shí)現(xiàn)利用微生物宿主生產(chǎn)一些萜類化合物,且有被商業(yè)化應(yīng)用的產(chǎn)品實(shí)例。本研究結(jié)合基因工程和發(fā)酵工程方法,在釀酒酵母中導(dǎo)入外源番茄紅素合成模塊,經(jīng)代謝途徑和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化,實(shí)現(xiàn)釀酒酵母中番茄紅素的合成,取得以下主要研究結(jié)果:通過(guò)文獻(xiàn)檢索和在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中篩選挖掘參與番茄紅素合成的關(guān)鍵酶,以來(lái)源于歐文氏菌的八氫番茄紅素合成酶CrtB和來(lái)源于紅法夫酵母的八氫番茄紅素脫氫酶CrtI在釀酒酵母中驗(yàn)證番茄紅素的合成,根據(jù)釀酒酵母密碼子的偏好性密碼子優(yōu)化后在單拷貝質(zhì)粒pRS41H中表達(dá),高效液相色譜(HPLC)分析證明在工程酵母中成功合成了番茄紅素,產(chǎn)量為0.038 mg/L。從底盤(pán)宿主種類、功能基因拷貝數(shù)和啟動(dòng)子類型等方面綜合性考慮,對(duì)番茄紅素合成途徑與底盤(pán)宿主的適配性進(jìn)行了研究。結(jié)果表明,以釀酒酵母CEN.PK2-1C為宿主,采用多拷貝質(zhì)粒pRS42K為載體,使用組成型啟動(dòng)子控制番茄紅素合成途徑表達(dá)時(shí),番茄紅素產(chǎn)量比初始菌株提高了約6倍,達(dá)到0.152 mg/L。為了優(yōu)化番茄紅素生物合成工程菌中的前體物供應(yīng),以釀酒酵母CEN.PK2-1C為宿主,采用基因組整合的方法過(guò)表達(dá)來(lái)源于大腸桿菌的異戊烯焦磷酸異構(gòu)酶和來(lái)源于嗜酸熱硫化葉菌的GGPP合成酶并耦合強(qiáng)化MVA合成途徑時(shí),番茄紅素合成水平顯著提高,其產(chǎn)量比初始菌株提高了約945.6倍,達(dá)到23.64 mg/L。工程菌發(fā)酵條件優(yōu)化研究表明,工程釀酒酵母合成番茄紅素的最佳條件為:酵母浸出粉10 g/L、蔗糖20 g/L、硫酸銨20 g/L、MgSO_4添加量0.05 g/L、K_2HPO_4·3H_2O添加量0.02 g/L,接種量A_(600)為0.05,裝液量為24%,搖床轉(zhuǎn)速200 r·min~(-1)、pH為6,發(fā)酵溫度28℃。檸檬酸補(bǔ)料批式發(fā)酵方式下,番茄紅素的產(chǎn)量達(dá)到79.42 mg/L,比發(fā)酵工藝優(yōu)化前提高了約3.36倍。上述結(jié)果說(shuō)明通過(guò)在釀酒酵母中導(dǎo)入外源番茄紅素合成模塊,經(jīng)代謝途徑和發(fā)酵過(guò)程優(yōu)化,顯著提高了番茄紅素合成水平。
【學(xué)位單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：TQ920.1;TQ28
【部分圖文】：

被廣泛用于生產(chǎn)番茄紅素。合成途徑合成代謝與調(diào)控一直是生物工程領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)徑中各種產(chǎn)物的共同前體物，異戊烯焦磷酸(IPP)生物體合成 IPP 來(lái)源的差異，番茄紅素的生物合 2-甲基-D-赤蘚糖醇-4-磷酸鹽(MEP)及存在于真種途徑[51]。MEP 途徑由丙酮酸和甘油醛-3-磷酸經(jīng)(DXP)，之后轉(zhuǎn)化成 MEP，再經(jīng)一系列酶的催二烯焦磷酸(IPP)和二甲基丙烯焦磷酸酯(DMAPP)催化生成乙酰乙酰輔酶 A (Acetoacetyl-CoA)后OA)生成 MVA，之后再經(jīng)幾步催化反應(yīng)生成 IPP。DMAPP 在法昵基焦磷酸合成酶的催化作用下生基香葉基焦磷酸合成酶、八氫番茄紅素合成酶和成番茄紅素，這 3 個(gè)酶分別由基因 CrtE、crtB 和圖 1-2 所示。

番茄紅素標(biāo)準(zhǔn)曲線

圖 2-2 角鯊烯標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖 2-3 法昵醇標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig. 2-2 Standard curve of squalene Fig. 2-3 Standard curve of farnesol釀酒酵母中角鯊烯、法昵醇等代謝產(chǎn)物使用氣相色譜儀進(jìn)行定性定量分析。所用氣相色譜儀是島津 GC2010，色譜柱為 TG-5MS（Thermo 30 m 0.25 mm 0.25 μm），使用的檢測(cè)器為 FID 檢測(cè)器，F(xiàn)ID 檢測(cè)器溫度為 300℃，進(jìn)樣方式為分流進(jìn)樣，載氣為氮?dú)猓M(jìn)樣量 1 μL，分流比為 30:1，進(jìn)樣口溫度為 250℃，柱箱程序升溫起始溫度為 80℃以 20℃/min 的速度升溫至溫度為 300℃，保持時(shí)間為 40 min。每個(gè)待測(cè)樣品平行測(cè)定 次。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2816656