木質(zhì)纖維素是天然的可再生原料,來(lái)源廣泛、價(jià)格低廉,將其作為原料生產(chǎn)脂質(zhì)可以顯著降低生產(chǎn)成本。木質(zhì)纖維素水解液中含量最高的單糖是葡萄糖,其次是木糖,如何提高木糖利用率是工業(yè)化利用木質(zhì)纖維素的關(guān)鍵問(wèn)題。卷枝毛霉(Mucor circinelloides)是研究脂質(zhì)積累機(jī)制的模式生物,曾用于生產(chǎn)γ-亞麻酸。分析卷枝毛霉的基因組信息發(fā)現(xiàn),它可能具有木糖異構(gòu)酶(xylose isomerase,XI)代謝路徑,但迄今未見(jiàn)報(bào)道。為進(jìn)一步提升卷枝毛霉作為產(chǎn)脂工業(yè)菌株的潛力,本文研究了卷枝毛霉的木糖代謝過(guò)程以及木糖代謝對(duì)其脂質(zhì)合成的影響,主要內(nèi)容如下:對(duì)比分析卷枝毛霉菌株CBS 277.49、CBS 108.16和WJ11的生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累情況,以木糖或葡萄糖為唯一碳源,結(jié)果表明卷枝毛霉通過(guò)XI路徑代謝木糖,且與葡萄糖代謝相比,木糖代謝對(duì)其生長(zhǎng)和脂質(zhì)積累沒(méi)有影響。以卷枝毛霉CBS 277.49的cDNA為模板,分別克隆得到編碼XI的基因xylA和編碼木酮糖激酶(xylulosekinase,XK)的基因XKS1,通過(guò)同源重組的方法連接到質(zhì)粒pMAT1552上得到表達(dá)載體pMAT1552-xylA和pMAT1552-XKS1。隨后將表達(dá)載體通過(guò)電擊轉(zhuǎn)化的方法轉(zhuǎn)入尿嘧啶缺陷的卷枝毛霉菌株p LEU-MU402,得到重組菌株Mc-XI和Mc-XK。pMAT1552也被轉(zhuǎn)入菌株pLEU-MU402,得到重組菌株Mc-1552,作為對(duì)照菌株。在單一碳源條件下培養(yǎng)重組菌株Mc-XI和Mc-XK,Mc-1552作為對(duì)照。結(jié)果表明過(guò)表達(dá)XI和XK均能顯著提高木糖的代謝速率和脂質(zhì)的產(chǎn)量,對(duì)脂肪酸組成沒(méi)有影響。在脂質(zhì)積累階段,菌株Mc-XI和Mc-XK中XI和XK的轉(zhuǎn)錄水平和酶活性均高于對(duì)照組,葡萄糖-6-磷酸脫氫酶(glucose 6-phosphatedehydrogenase,G6PDH)和6-磷酸葡糖糖酸脫氫酶(6-phosphogluconate dehydrogenase,6PGDH)的活性也顯著高于對(duì)照組菌株。采用葡萄糖(33 g/L)與木糖(17 g/L)質(zhì)量比約為2:1的混合碳源培養(yǎng)Mc-1552、Mc-XI和Mc-XK,結(jié)果表明過(guò)表達(dá)XI和XK有助于緩解葡萄糖抑制效應(yīng)。與Mc-1552相比,重組菌株的木糖代謝速率分別提升了37%和25%,總脂肪含量提高了8%和28%。此外,轉(zhuǎn)錄水平和酶活分析發(fā)現(xiàn)葡萄糖的存在,在一定程度上抑制了XK的轉(zhuǎn)錄,重組菌株的XI和XK酶活均高于對(duì)照組,轉(zhuǎn)錄水平與酶活性變化的趨勢(shì)基本相同。構(gòu)建xylA和XKS1基因的融合表達(dá)載體pMAT1552-xylA+XKS1,經(jīng)電擊轉(zhuǎn)化獲得融合表達(dá)XI和XK的重組菌株Mc-OL。在木糖或混糖為碳源的情況下,Mc-OL與Mc-1552相比能夠顯著提高木糖代謝速率,但是脂質(zhì)產(chǎn)量幾乎沒(méi)有增長(zhǎng),這可能是因?yàn)槿诤媳磉_(dá)后重組菌株中積累了大量的D-木酮糖五磷酸,造成流向脂質(zhì)合成的碳流量發(fā)生流失;同時(shí)重組菌株中XK酶活的提高,會(huì)導(dǎo)致胞內(nèi)的ATP過(guò)度消耗,同樣不利于脂質(zhì)積累。
【學(xué)位單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：TE667;TQ920.1
【部分圖文】：

依據(jù)木質(zhì)纖維素生產(chǎn)脂質(zhì)可以實(shí)現(xiàn)資源的綜合利用，減少原料成本。絲維素為脂質(zhì)的理想微生物之一，然而它們幾乎都是通過(guò) XR/XDH 代謝率不高，因此研究大都采用在絲狀真菌中構(gòu)建 XI 路徑的方法在微生物內(nèi)異源表達(dá) XI 或者 XK，均能有效提高木糖代謝率從而產(chǎn)量。 XI 來(lái)源的限制，目前在絲狀真菌中實(shí)現(xiàn)高活性表達(dá)的 XI 很少，而菌細(xì)胞內(nèi)沒(méi) XI，研究細(xì)胞內(nèi) XI 和 XK 之間的相互作用更少。卷枝基因組信息提示，該菌株可能具有 XI 代謝路徑。檢索卷枝毛霉 CB發(fā)現(xiàn)編碼 XI 的基因 xylA、編碼 XK 的基因 XKS1 和編碼 XDH 的基組中。根據(jù)基因組信息推測(cè)卷枝毛霉 CBS277.49 的木糖代謝路徑如糖通過(guò) XI 路徑轉(zhuǎn)化為 X5P 進(jìn)入 PPP 完成后續(xù)代謝。由于存在 XD木酮糖在 XDH 的作用下生成木糖醇。

圖 3-1 卷枝毛霉 CBS 277.49（a1 和 b1）、CBS 108.16（a2 和 b2）和 WJ11（a3 和 b3）的生物量、脂肪酸含量及脂肪酸組成Fig.3-1 The biomass, lipid content and fatty acids profile of M. circinelloides CBS 277.49 (a1 and b1CBS 108.16 (a2 and b2), WJ11 (a3 and b3)注：標(biāo)有不同字母表示具有顯著性差異，P<0.05。木糖的利用對(duì)使用木質(zhì)纖維素為原料生產(chǎn)脂質(zhì)十分重要，然而很多產(chǎn)油真菌不能利用木糖或者通過(guò) XR/XDH 路徑以較低的速率代謝木糖。此外，葡萄糖作為微生物生長(zhǎng)的一種常見(jiàn)碳源，微生物代謝木糖產(chǎn)生的生物量和脂質(zhì)產(chǎn)量大多數(shù)都低于代謝葡萄糖時(shí)的量，且在兩種糖共存的情況下，優(yōu)先代謝葡萄糖用于生長(zhǎng)所需。然而，本課題使用的卷枝毛霉在木糖或葡萄糖分別作為碳源時(shí)得到的生物量和脂質(zhì)產(chǎn)量幾乎相同，這可能是由于卷枝毛霉內(nèi)部木糖代謝路徑和其他代謝路徑的協(xié)同影響（圖 3-2）。

圖 3-2 卷枝毛霉中的木糖代謝Fig. 3-2 Xylose metabolic in M.circinelloides：X5P，木酮糖-5-磷酸；G3P，甘油醛-3-磷酸；F6P，果糖-6-磷酸；GPI，葡萄糖-6-磷酸異酶；G6P，葡萄糖-6-磷酸；G6PDH，葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；6PGL，葡萄糖酸-6-磷酸內(nèi)酯；GLS，葡萄糖酸-6-磷酸內(nèi)酯酶；6PG，葡萄糖酸-6-磷酸；6PGDH，6-磷酸葡萄糖酸脫氫酶Ru5P，核糖-5-磷酸。在卷枝毛霉中，木糖首先被轉(zhuǎn)化為 X5P 然后進(jìn)入 PPP 的非氧化階段從而進(jìn)入。有報(bào)道稱當(dāng)木糖為碳源時(shí)，通過(guò) PPP 非氧化階段的碳流量會(huì)高于葡萄糖為碳量[55,82]。上調(diào)的碳流量會(huì)使甘油醛-3-磷酸（glyceraldehyde-3-phosphate，G3P）-6-磷酸（fructose-6-phosphate，F(xiàn)6P）的產(chǎn)量增加，從而增加進(jìn)入 PPP 氧化階段途徑的 G3P 和 F6P 的量，積累更多的 NADPH 和 ATP 供脂質(zhì)合成所需。此外碳源時(shí)卷枝毛霉發(fā)酵產(chǎn)生的乙醇產(chǎn)量低于葡萄糖為碳源時(shí)的產(chǎn)量，這也從另一了木糖代謝會(huì)比葡萄糖代謝積累更少的代謝副產(chǎn)物。更少的代謝副產(chǎn)物積累也糖對(duì)脂質(zhì)的轉(zhuǎn)化率高于葡萄糖的原因之一。

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前1條

1 張變玲;張儒;姬婧媛;薛柯;荊二勇;張展鵬;尉亞輝;;重疊延伸PCR法克隆人脂聯(lián)素基因及其在畢赤酵母中表達(dá)[J];生物工程學(xué)報(bào);2008年08期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 唐鑫;產(chǎn)油真菌卷枝毛霉WJ11高產(chǎn)脂質(zhì)的分子機(jī)制[D];江南大學(xué);2016年

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1 欒霄;過(guò)表達(dá)脫飽和酶對(duì)卷枝毛霉γ-亞麻酸合成的影響[D];江南大學(xué);2015年

本文編號(hào)：2814932