【摘要】：由于納米材料具有獨(dú)特的物理和化學(xué)性質(zhì),已經(jīng)成為制造新型光學(xué)納米探針的優(yōu)質(zhì)材料。納米材料的性能高度依賴于其可調(diào)控的尺寸和形狀,當(dāng)它們與特定的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制組件結(jié)合時(shí),可以顯著的提高對(duì)分析物檢測(cè)的靈敏度和特異性。本課題的主要研究?jī)?nèi)容概括如下:(1)由于抗腫瘤藥物具有疏水性和不穩(wěn)定等缺點(diǎn),而納米載體能有效改善的藥物的疏水性,并促進(jìn)藥物的遞送和細(xì)胞的攝取。在此,我們構(gòu)建了一種多功能球形核酸納米膠束藥物遞送系統(tǒng),具有高效的藥物遞送率和治療效果。首先,利用輔助分離材料磁性微球-金納米顆粒(MB-AuNPs),通過(guò)磁性分離技術(shù),有效提高了紫杉醇-核酸(PTX-DNA)復(fù)合物的分離效率。其次,利用DNA作為親水端和PTX作為疏水端,合成PTX-DNA兩性納米膠束單體。將PTX-DNA單體與PTX-DNA/FAM單體自組裝形成球形納米膠束。且球形納米材料比其他形狀的材料更容易被細(xì)胞吞噬,有效的提高了PTX的遞送率。使用生物還原活化的二硫化物將疏水性PTX與DNA連接。當(dāng)納米膠束被細(xì)胞攝取后,在谷胱甘肽(GSH)存在下,二硫鍵被切割使納米膠束散開(kāi),成功實(shí)現(xiàn)PTX的釋放。該方案具有高效的分離效率,成功實(shí)現(xiàn)每個(gè)步驟的分離時(shí)間僅為60 s,極大的縮短了材料的合成時(shí)間,避免了耗時(shí)且勞動(dòng)密集等缺點(diǎn)。通過(guò)熒光顯微鏡和流式細(xì)胞術(shù)證明PTX-DNA納米膠束的成功攝取和藥物的成功釋放。所合成的納米膠束具有更優(yōu)的親水性、更好的生物相容性、更高的穩(wěn)定性、單分散尺寸和更高的治療潛力。我們相信該方法在臨床研究應(yīng)用等方面,具有重大的研究潛力。(2)循環(huán)腫瘤細(xì)胞(CTCs)是指具有高活力和轉(zhuǎn)移潛能的腫瘤細(xì)胞。因此,CTCs的檢測(cè)對(duì)早期腫瘤的臨床診斷具有重要意義。近年來(lái),不同納米結(jié)構(gòu)在基底上的整合和相應(yīng)特異性識(shí)別分子的修飾已成為CTCs從全血樣品中高效捕獲的最常用方法。粗糙的納米界面具有較大的比表面積,可以連接更多的適體DNA,有效的增加了CTCs的捕獲率;但粗糙界面極易造成非特異性細(xì)胞粘附,導(dǎo)致假陽(yáng)性的存在。因此,通過(guò)利用抗污染分子能夠有效的降低非靶細(xì)胞的粘附。聚乙二醇(PEG)分子在“軟”基質(zhì)上進(jìn)行修飾能有效改善界面的親水性,同時(shí)降低細(xì)胞的非特異性粘附。在此,我們?cè)O(shè)計(jì)了一種基于抗污染材料PEG的金納米花基底高效捕獲和無(wú)損傷釋放CTCs。一方面,該平臺(tái)使用的虛擬PEG模板既能提高界面的生物相容性,又能有效地控制非特異性細(xì)胞粘附;另一方面,金納米花基底具有粗糙的表面,顯著提高適體在金納米花基底的連接效率來(lái)增加CTCs的捕獲效率。在金納米花基底上,使用DNA適體功能化后表現(xiàn)出優(yōu)異的捕獲特異性。與其他納米結(jié)構(gòu)相比,及時(shí)在低細(xì)胞密度下,金納米花基底具有較大的捕獲能力。通過(guò)對(duì)釋放后的CTCs進(jìn)行培養(yǎng),細(xì)胞活力和增殖情況均表現(xiàn)正常。這項(xiàng)工作為少量CTCs的高效捕獲和無(wú)損傷釋放提供了策略,我們相信它在臨床檢測(cè)方面具有較大的潛力。(3)CTCs在外周血中含量非常低,在1000萬(wàn)個(gè)白細(xì)胞和50億個(gè)紅細(xì)胞中含有1-10 CTCs/mL,因此高靈敏性檢測(cè)大量正常細(xì)胞中少量的CTCs是極其困難的�；谫F金屬納米粒子的獨(dú)特性質(zhì),表面增強(qiáng)拉曼散射技術(shù)(SERS)可以極大地放大單分子的光譜信號(hào)。因此,基于SERS的檢測(cè)方法可以為CTCs檢測(cè)提供多種策略的強(qiáng)大分析工具。在此,我們開(kāi)發(fā)了一種基于金納米星(AuNS)和雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(HCR)多重拉曼信號(hào)增強(qiáng)機(jī)制,以及DNA適體和AE的雙重識(shí)別機(jī)制,高靈敏檢測(cè)和高特異性識(shí)別CTCs。通過(guò)構(gòu)建信號(hào)探針:在AuNS表面功能化PEG分子,具有較高的穩(wěn)定性并且減少非特異性捕獲吸附,同時(shí)提供氨基,以便后續(xù)連接引發(fā)鏈DNA和抗-上皮細(xì)胞粘附分子(AE)。其中通過(guò)引發(fā)鏈DNA引發(fā)修飾ROX的發(fā)卡H1和發(fā)卡H2,實(shí)現(xiàn)HCR,產(chǎn)生強(qiáng)烈的SERS信號(hào)。當(dāng)通過(guò)修飾在金納米花基底上的DNA適體和信號(hào)探針上的AE,雙重識(shí)別CTCs,極大的提高了復(fù)雜全血樣品中的細(xì)胞捕獲的特異性。之后,適體互補(bǔ)鏈被用與適體DNA雜交以實(shí)現(xiàn)修飾有信號(hào)探針HCR/AE/PEG/AuNS的CTCs的釋放。在最佳釋放條件下,可以實(shí)現(xiàn)完全釋放和收集CTCs以檢測(cè)拉曼信號(hào)。實(shí)現(xiàn)在1至100 cells/mL范圍內(nèi),具有良好的線性,并且檢測(cè)限達(dá)到1 cell/mL。
【學(xué)位授予單位】：青島科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ460.1;O657.3
【圖文】：

料具有獨(dú)特的化學(xué)性質(zhì)，通過(guò)調(diào)控其形狀和結(jié)構(gòu)，使納米材料靈敏度和特定性能[1]。納米材料的這種獨(dú)特性質(zhì)以及他們整體用于多種傳感器的巨大潛力。因此，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了基于多種納米法，例如金納米材料[2-5]，量子點(diǎn)[6]，殼聚糖納米材料[7-8]，納米測(cè)分析物的高靈敏度，在免疫測(cè)定中使用光學(xué)納米探針開(kāi)發(fā)信極大的關(guān)注。然而，由于酶與檢測(cè)抗體之間的比例為 1：1，常受到限制。為了實(shí)現(xiàn)高靈敏度這一目標(biāo)：一方面，利用納米，增加多種信號(hào)探針（例如，生物分子，熒光染料和拉曼報(bào)道有效的放大信號(hào)；另一方面，在生化反應(yīng)的幫助下產(chǎn)生的指示放大。材料的性質(zhì)納米材料的高靈敏免疫分析方法中，納米材料的特性具有較-1 所示，納米材料的局部等離子共振（LSPR）性質(zhì)、納米材米材料的表面增強(qiáng)拉曼（SERS）性質(zhì)。

基于 AChE 催化的水解反應(yīng)的比色測(cè)定方案，用于檢測(cè)腸病毒 71（EVhE 催化乙酰膽堿的水解，生成乙酸和膽堿。（b）改進(jìn)的夾心 ELISA 形-2 Scheme of the colorimetric assay based onAChE-catalyzed hydrolysis ref enterovirus 71 (EV71)[16]. (a)AChE catalyzes the hydrolysis of acetylcholiacetate and choline. (b) The improved sandwich ELISA format.距離的變化之外，尺寸的變化是設(shè)計(jì)比色傳感器的另一個(gè)有 1-3 所示，基于酶促的控制 AuNPs 活性的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制被定中的蛋白質(zhì)的超靈敏檢測(cè)[17]。在該方法中，首先通過(guò)特，所述特異性抗體在固體基質(zhì)上預(yù)先固定，隨后通過(guò)第二抗體消耗過(guò)氧化氫，并且其活性與 AuNPs 的生長(zhǎng)相關(guān)，以在存情況下產(chǎn)生藍(lán)色或紅色溶液。在不存在分析物的情況下，金化氫存在下迅速降低，這有利于形成具有紅色的球形非聚，在存在分析物的情況下，酶導(dǎo)致過(guò)氧化氫濃度降低，這聚集的納米顆粒的不明確的形態(tài)。藍(lán)/紅色變化允許用肉眼檢

1-2 基于 AChE 催化的水解反應(yīng)的比色測(cè)定方案，用于檢測(cè)腸病毒 71（EV71）AChE 催化乙酰膽堿的水解，生成乙酸和膽堿。（b）改進(jìn)的夾心 ELISA 形式。ig. 1-2 Scheme of the colorimetric assay based onAChE-catalyzed hydrolysis reactioion of enterovirus 71 (EV71)[16]. (a)AChE catalyzes the hydrolysis of acetylcholine toacetate and choline. (b) The improved sandwich ELISA format.了距離的變化之外，尺寸的變化是設(shè)計(jì)比色傳感器的另一個(gè)有吸引圖 1-3 所示，基于酶促的控制 AuNPs 活性的信號(hào)產(chǎn)生機(jī)制被開(kāi) 測(cè)定中的蛋白質(zhì)的超靈敏檢測(cè)[17]。在該方法中，首先通過(guò)特異性子，所述特異性抗體在固體基質(zhì)上預(yù)先固定，隨后通過(guò)第二抗體用以消耗過(guò)氧化氫，并且其活性與 AuNPs 的生長(zhǎng)相關(guān)，以在存在或的情況下產(chǎn)生藍(lán)色或紅色溶液。在不存在分析物的情況下，金離子氧化氫存在下迅速降低，這有利于形成具有紅色的球形非聚集金而，在存在分析物的情況下，酶導(dǎo)致過(guò)氧化氫濃度降低，這導(dǎo)致的聚集的納米顆粒的不明確的形態(tài)。藍(lán)/紅色變化允許用肉眼檢測(cè)

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