【摘要】：寡核苷酸作為一類序列較短的核酸分子,是生命科學和生物醫(yī)學研究中調(diào)節(jié)基因表達的基本工具。人工合成的寡核苷酸通過化學修飾可以增加其在生物體內(nèi)的穩(wěn)定性,并被開發(fā)為基因治療靶向藥物,用于許多與基因相關的疾病如病毒、腫瘤和遺傳病等的治療。與此同時,如何快速、有效、準確地鑒別寡核苷酸所攜帶的修飾類型以及修飾位點也為其分離分析方法的開發(fā)帶來了挑戰(zhàn)。核酸和蛋白質(zhì)是兩類密切相關的生物大分子,通過彼此間的相互作用可以對各自的生命周期和生物學功能進行調(diào)節(jié)。核酸蛋白間的相互作用是決定細胞內(nèi)平衡的關鍵因素,破壞核酸蛋白的相互作用將會導致細胞的功能紊亂以及相關疾病的發(fā)生。核酸與蛋白相互作用的研究涉及寡核苷酸與多肽的液相質(zhì)譜聯(lián)用分析,而寡核苷酸和多肽分子所存在的理化性質(zhì)差異使得兩者的同時分析難以實現(xiàn)�；诠押塑账豳|(zhì)譜分析的現(xiàn)實需求和研究難點,包括傳統(tǒng)離子對試劑引起的寡核苷酸質(zhì)譜信號抑制、寡核苷酸在質(zhì)譜正離子模式靈敏度低、寡核苷酸難以和多肽在正離子模式同時進行液相質(zhì)譜聯(lián)用分析以及寡核苷酸化學修飾和序列信息的快速鑒定等,本論文針對性地提出了改進的分析策略,具體內(nèi)容包括以下三部分:有機氣氛輔助的電噴霧離子化策略用于提高寡核苷酸的質(zhì)譜檢測靈敏度:寡核苷酸的液相質(zhì)譜聯(lián)用分析主要存在兩方面的挑戰(zhàn),分別是由離子對試劑引起的質(zhì)譜信號抑制以及寡核苷酸在質(zhì)譜正離子模式下的靈敏度較低。我們通過將高濃度的醇類氣氛引入封閉的電噴霧離子源,成功緩解了高濃度離子對試劑(100mM TEAA)所引起的寡核苷酸在質(zhì)譜負離子模式下的信號抑制效應。在該緩沖體系中,相比于常規(guī)離子化方式,寡核苷酸樣品dT15在異丙醇氣氛的輔助下,其質(zhì)譜信號強度提高了約600倍。隨后,寡核苷酸的高效液相分離和高靈敏度質(zhì)譜檢測得以同時實現(xiàn)。另外,通過丙酸氣氛的輔助,寡核苷酸得以在質(zhì)譜正離子模式下成功檢測,且并無明顯加合峰出現(xiàn)。相比于直接通過溶液加酸的方式,丙酸氣氛輔助下的寡核苷酸質(zhì)譜正離子模式信號強度提高至少10倍以上。最后,通過丙酸氣氛輔助的離子化策略,寡核苷酸和多肽以及組蛋白樣品得以同時在正離子模式下進行分析,且相互之間干擾并不明顯�？偠灾�,有機氣氛輔助的離子化策略將會對寡核苷酸的生物學功能探索提供有效的幫助。離子對反相色譜與正離子模式質(zhì)譜聯(lián)用下的寡核苷酸分離分析:由于自身攜帶有電負性極強的磷酸二酯骨架結(jié)構,寡核苷酸通常通過離子對反相色譜與負離子模式下的電噴霧質(zhì)譜聯(lián)用進行分析。我們通過顯著提高源內(nèi)裂解能量,成功緩解了由離子對試劑三乙胺和六氟異丙醇引起的寡核苷酸在質(zhì)譜正離子模式下的大量三乙胺加合峰干擾。隨后,我們將該策略用于RNA型寡核苷酸的酸解測序分析,發(fā)現(xiàn)正離子模式下的測序結(jié)果較傳統(tǒng)負離子模式更具優(yōu)勢。最終,采用該策略,我們成功實現(xiàn)了寡核苷酸樣品與多肽樣品在正離子模式下的離子對反相色譜質(zhì)譜聯(lián)用分析,且相互間的干擾較少。采用不同基質(zhì)輔助的激光解析質(zhì)譜源內(nèi)裂解下的小干擾RNA的修飾位點鑒定及序列表征:人工合成的醫(yī)用siRNA由于攜帶大量的化學修飾以及其裂解碎片在電噴霧離子化過程中容易攜帶多電荷產(chǎn)生信號干擾,通過串聯(lián)質(zhì)譜進行序列鑒定其質(zhì)譜結(jié)果通常過于復雜且難以分析。我們通過激光解析質(zhì)譜的源內(nèi)裂解方式并配合不同的基質(zhì)sDHB和3-HPA對多修飾的siRNA樣品SR-2M2-AS進行了修飾位點鑒定和序列表征。siRNA源內(nèi)裂解的主要碎片類型與所用基質(zhì)密切相關,采用基質(zhì)sDHB得到d/y型碎片離子而采用基質(zhì)3-HPA則得到了a/w型碎片離子,而兩種基質(zhì)分別得到的源內(nèi)裂解結(jié)果都可用于siRNA的快速測序。另外,2'-F修飾將會阻止院內(nèi)裂解碎片的產(chǎn)生,對此我們提出了相應的裂解機理。在掌握了不同基質(zhì)下的siRNA源內(nèi)裂解規(guī)律后,這必將成為一種快捷、簡單、準確和有效的用于siRNA修飾位點鑒定和序列分析的方法。
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：O657.63;TQ464.6
【圖文】：

［２４１。逡逑如圖１．２所示為整個ＲＮＡｉ的作用通路［２５，２６］。首先，當?shù)鞍祝模椋悖澹颍簦玻罚睂ⅲ遥危铃义霞羟谐桑玻钡剑玻祩�核苷酸鏈長時，整個ＲＮＡｉ通路正式開啟Ｉ２８】。這些�。遥危铃澹ò义侠ǎ螅椋遥危梁停恚椋遥危粒⿲⒈徽铣桑遥危两閷У某聊瑥秃衔铮ǎ遥危铃澹椋睿洌酰悖澹溴澹螅椋欤澹睿悖椋睿珏义希悖铮恚穑欤澹�，邋ＲＩＳＣ）邋［２９】，這也是大部分人工合成的ＲＮＡｉ效應分子進入作用通路的逡逑起點。當然，人工合成的ｓｉＲＮＡ分子需要通過激酶Ｃｌｐｌ將其５’端磷酸化后才會逡逑被激活ｌ３Ｇ］。在ｓｉＲＮＡ的５’端被磷酸化之后，ＲＩＳＣ復合物會與雙鏈ｓｉＲＮＡ中的逡逑１２逡逑

譜的基礎上在流動相中加入了離子對試劑（也就是各種帶正電的胺類化合物），逡逑以增強其與寡核苷酸的相互作用。逡逑如圖１．４所示，離子對試劑增強寡核苷酸在反相色譜上的保留原理主要基于逡逑兩點：首先，帶正電的離子對試劑會與帶負電的寡核苷酸磷酸骨架在溶液中構成逡逑離子對，減少了寡核苷酸的凈電荷并增加了其疏水性，此時疏水相互作用促成了逡逑寡核苷酸在離子對反相色譜中的保留；再者，離子對試劑依靠其疏水性烷基鏈可逡逑以吸附于反相色譜的固定相上以形成離子交換劑（Ｉｏｎ邋ｅｘｃｈａｎｇｅｒ），此時靜電相逡逑互作用將幫助寡核苷酸在反相色譜中的保留［８３，８４］。逡逑／，邋？邋°逡逑Ｉｏｎ邋ｐａｉｒｉｎｇ邋ｉｎ邋ｓｏｌｕｔｉｏｎ邐０0—ｐ＝0逡逑0邋Ｗ逡逑＾邋Ｈ６ｉＨＨ逡逑Ｉｏｎ邋ｅｘｃｈａｎｇｅ邐Ｑ0—ｐ＝ｏ逡逑＼ｆ＾邐Ｈ邋Ｏ邋ＯＨ逡逑ｅ0－ｆ＝0逡逑／ｎ邐Ａｔｒ逡逑——Ｓｉ—逡逑（ｉ逡逑圖１．４寡核苷酸在離子對反相色譜上的保留原理。逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．４邋Ｓｃｈｅｍｅ邋ｏｆ邋１Ｐ－ＲＰＬＣ邋ｍｅｃｈａｎｉｓｍ邋ｏｆ邋ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅｓ邋ｒｅｔｅｎｔｉｏｎ．逡逑Ｉ逡逑１９逡逑

Ｄｉｃｋｍａｎ等證明用添加ＴＥＡＡ的離子對反相色譜可以實現(xiàn)長達４５８ｂｐ的雙鏈逡逑ＤＮＡ分子的分離分析心，％。逡逑如圖１．５所示，ＴＥＡＡ的濃度直接關系到分離效果，寡核苷酸分離所用的逡逑ＴＥＡＡ濃度通常需要１００ｍＭ以及采用ｐＨ＝７的乙腈流動相體系。如此高濃度的逡逑ＴＥＡＡ流動相體系，寡核苷酸難以在質(zhì)譜中產(chǎn)生信號，紫外檢測器幾乎成為標配逡逑［９１］。最近，Ｇｏｎｇ等在優(yōu)化了各項液質(zhì)條件后得出ＴＥＡＡ濃度在３０ｍＭ可以兼顧逡逑核酸的液相分離度和質(zhì)譜的檢測靈敏度［９２］。逡逑ＴＥＡＡ總共有兩部分組成，三乙胺和乙酸。其中，三乙胺是寡核苷酸分離分逡逑析最為常用的離子對試劑，故而，大量的研究聚焦于抗衡離子（Ｃｏｕｎｔｅｒｉｏｎ）乙逡逑酸根離子對于質(zhì)譜信號的影響＾在電噴霧離子化去溶劑的過程中，三乙胺（８９°Ｃ）逡逑和乙酸（１１８°Ｃ）的沸點差異將起到?jīng)Q定性的作用［４２］。當離子對反相色譜與質(zhì)譜逡逑聯(lián)用時，三乙胺在電噴霧液滴中的蒸發(fā)速度明顯快于乙酸，而乙酸在電噴霧液滴逡逑中的大量聚集會降低體系的ｐＨ值，并通過與寡核苷酸的離子化過程產(chǎn)生競爭從逡逑而降低了寡核苷酸的離子化效率

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