【摘要】：發(fā)光桿菌(Photohabdus temperate)是寄生于異小桿線蟲(Heterorhabditis)腸道內(nèi)的共生菌,被線蟲攜帶進入昆蟲體內(nèi)后大量繁殖并產(chǎn)生大量的次生代謝產(chǎn)物,協(xié)同線蟲一起殺死寄主昆蟲。目前,從發(fā)光桿菌屬的次生代謝產(chǎn)物中分離得到的二苯乙烯類化合物具有多種生物活性。為促進其在農(nóng)業(yè)抗生素領(lǐng)域應(yīng)用價值的開發(fā),本試驗通過對發(fā)光桿菌SN35進行大量發(fā)酵,采用固相萃取、柱層析和高效液相色譜等化學(xué)分離技術(shù)從發(fā)光桿菌SN35的發(fā)酵液粗提物中分離純化得到9個活性化合物。通過NMR和MS波譜技術(shù)和相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研確定了這9個活性化合物的結(jié)構(gòu),并初步探究了它們的生物活性。通過Plackett-Burman試驗和響應(yīng)面法對發(fā)光桿菌SN35搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。主要結(jié)果如下:1.發(fā)光桿菌SN35菌株次生代謝產(chǎn)物的分離純化及鑒定:對發(fā)光桿菌SN35進行大量發(fā)酵,獲得48 L發(fā)酵液,利用大孔樹脂固相吸附、二氯甲烷萃取共得到12.90 g粗提物。利用硅膠柱層析、凝膠柱層析和高效液相色譜等化學(xué)分離技術(shù)對粗提物進行分離純化,共得到9個活性化合物。通過NMR和MS波譜技術(shù)和相關(guān)文獻(xiàn)調(diào)研確定了9個活性化合物的結(jié)構(gòu),分別為temperatacinol A(1),temperatacinol B(2),temperatacinol C(3),temperatacinol D(4),3-羥基-2-異丙基-5-苯乙基苯基氨基甲酸酯(5),2-(1-羥基丙烷-2-基)-5-[2-苯乙基]苯-1,3-二醇(6),2-(1-羥基丙烷-2-基)-5-[(E)-2-苯乙烯基]苯-1,3-二醇(7),2-乙基-5[(E)-2-苯乙烯基]苯-1,3-二醇(8),2-異丙基-5-[(E)-2-苯乙烯基]苯-1,3-二醇(9),命名為化合物1-9。其中化合物1為新化合物,化合物2和3為第一次被分離純化得到,之前已從發(fā)光桿菌的代謝產(chǎn)物中用HPLC/MS分析說明過,化合物4-9為已知化合物。2.化合物1-9抗真菌活性測定:采用菌絲生長速率法和微量肉湯稀釋法對化合物1-9的生物活性做了測定。結(jié)果表明,化合物9(isopropylstilbene)對玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌和玉米紋枯病菌的菌絲生長具有良好的抑制作用,其EC_(50)值分別為10.5μg/mL,9.2μg/mL和9.8μg/mL,對水稻稻瘟病菌的抑制作用稍微差一點,EC_(50)值為29.4μg/mL�；衔�5、6和7對玉米大斑病菌、番茄灰霉病菌和玉米紋枯病菌的抑制作用一般,對水稻稻瘟病菌的抑制作用較差�；衔�1、2、3和4對4種病原真菌的抑制作用都較弱,其EC_(50)值均大于50μg/mL。比較9個化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)和其對應(yīng)的生物活性,可推測出C-5上連接苯乙烯基(苯乙基)比連接烷基鏈有助于提高化合物的抑菌活性。3.isopropylstilbene(化合物9)對番茄灰霉病菌的離體抑菌活性及對灰霉病的防治效果:依據(jù)化合物的離體生物活性篩選結(jié)果,對生物活性較好的isopropylstilbene做了進一步的研究。采用凹玻片法測定了isopropylstilbene對番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用,結(jié)果顯示在10μg/mL,isopropylstilbene對番茄灰霉病菌孢子萌發(fā)的抑制作用為63.01%(百菌清為100%)。通過番茄盆栽試驗,測定了isopropylstilbene對灰霉病的防治效果,當(dāng)有效成分質(zhì)量濃度為200μg/mL時,5%isopropylstilbene乳油對番茄灰霉病的防治效果為72.12%,其防效略低于陽性對照百菌清(81.61%)。對isopropylstilbene進行了簡單的室內(nèi)藥害試驗,當(dāng)有效成分質(zhì)量濃度為500μg/mL時,5%isopropylstilbene乳油對黃瓜苗和番茄苗均未產(chǎn)生藥害。4.isopropylstilbene定量方法的建立:建立了高效液相色譜法快速測定發(fā)光桿菌發(fā)酵液中isopropylstilbene含量的方法。色譜條件:色譜柱:Agilent ZORBAX Eclipse XDB,(4.60×250mm,5μm);流動相:68%甲醇水+0.1%甲酸溶液;進樣體積:10μL;流速:1.0 mL/min,柱溫:30-39℃;檢測波長:247 nm。該方法的精密度RSD為0.56-2.62%,回收率為93.71-109.62%,線性方程為Y=10069X+3.7629(R~2=0.9974),線性范圍是:0.002-5 g/L,以3倍信噪比計算最小檢出限為2 mg/L,以10倍信噪比計算定量限為10mg/L。5.優(yōu)勢菌株篩選和發(fā)酵條件優(yōu)化:通過薄層色譜法和高效液相色譜法對本實驗室?guī)齑娴?8種發(fā)光桿菌進行了優(yōu)勢菌株篩選,結(jié)果均顯示發(fā)光桿菌SN35的發(fā)酵液中isopropylstilbene的含量最多。通過單因素試驗、Plackett-Burman試驗和響應(yīng)面法對發(fā)光桿菌SN35的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件進行了優(yōu)化。單因素試驗結(jié)果顯示,在M培養(yǎng)基中添加亮氨酸,大大提高了isopropylstilbene的產(chǎn)量,在M培養(yǎng)基中添加氯化鈉的量為3.01 g/L時有助于isopropylstilbene產(chǎn)量的提高。優(yōu)化后的M培養(yǎng)基組成為:葡萄糖6.13 g/L,蛋白胨33.23 g/L,硫酸鎂1.50 g/L,硫酸銨2.46 g/L,磷酸二氫鉀0.86 g/L,磷酸氫二鉀1.11 g/L,硫酸鈉1.72 g/L,亮氨酸3.00 g/L,氯化鈉3.01 g/L,蒸餾水1 L,pH值7.2-7.6。isopropylstilbene產(chǎn)量比優(yōu)化前提高了2.22倍。
【學(xué)位授予單位】：沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ455.4
【圖文】：

看出每個因素對響應(yīng)值的影響及因素之間條件組合。用 Box-Behnken designs（BBD）或中）。這兩種方法均可以對試驗結(jié)果進行二它們的試驗次數(shù)都大于試驗因素數(shù)量的 目前中心組合試驗應(yīng)用的較為廣泛，因點可以用來檢查彎曲，用于計算試驗誤差（劉樂樂，2010）。然而 Box-Behnken 設(shè)同時都處在高水平。Central Composite designs, CCD）是國際計法（Maneeboon et al, 2010）。該法一它們按照中心組合的方式組合起來，試驗

5 菌株發(fā)酵液粗提物 TLrude extract from Photoh析結(jié)果硅膠柱（350 mm ×300:5、 100:10、100:的 23 個餾分進行 TL將含有相同極性的化 g，其中 a 為 0.131 g，回收率為 87.70%

圖 2-1 SN35 菌株發(fā)酵液粗提物 TLC 檢測結(jié)果Fig. 2-1 The TLC results of crude extract from Photohabdus temperata SN35 strain SN35 菌株粗提物的硅膠柱層析結(jié)果將收集到的 12.90 g 浸膏用正相硅膠柱（350 mm ×30 mm i.d.）分離純化，依次選油醚）: V（乙酸乙酯）=（100:5、 100:10、100:20、100:30、100:40 和 0:100洗脫，每個梯度 3 L。將收集到的 23 個餾分進行 TLC 檢測，以 V（石油醚）: V（酯）= 8:2，檢測結(jié)果如圖 2-2，將含有相同極性的化合物進行合并稱重分為 a-f 6。分離后的樣品總重量為 11.31 g，其中 a 為 0.131 g，b 為 2.388 g，c 為 5.606 g，.960 g，e 為 0.124 g，f 為 2.105 g，回收率為 87.70%。

【相似文獻(xiàn)】

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1 王保娟;發(fā)光桿菌SN35菌株次生代謝產(chǎn)物的分離鑒定及其抑菌活性研究[D];沈陽農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

本文編號：2778940