發(fā)布時(shí)間：2020-08-01 11:32

【摘要】：四氫呋喃-2-甲酸又稱2-四氫糠酸,光學(xué)純的四氫呋喃-2-甲酸是制備多種藥物及化工原料的重要中間體。目前工業(yè)上拆分四氫呋喃-2-甲酸的方法以化學(xué)法為主,如使用麻黃堿多次進(jìn)行拆分,該方法存在毒性大、步驟繁復(fù)、環(huán)境污染大等缺點(diǎn)。目前較少有使用生物法拆分的報(bào)道,且四氫呋喃-2-甲酸以及四氫呋喃-2-甲酸甲酯作為酸和酯類的物質(zhì),可使用脂肪酶作為其酯化或水解的反應(yīng)催化劑,因此進(jìn)行了酶法拆分四氫呋喃-2-甲酸以及四氫呋喃-2-甲酸甲酯的研究。以外消旋的四氫呋喃-2-甲酸為底物,使用了不同脂肪酶催化其與正丁醇的酯化反應(yīng),篩選出立體選擇性較好的脂肪酶:Novozym 435。該脂肪酶以吡啶為溶劑,酸醇比為1:2,在30℃條件下反應(yīng)為最佳條件。在此條件下,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.1 mol/L,加酶量20 g/L,反應(yīng)時(shí)間12 h,轉(zhuǎn)化率為60%,產(chǎn)物(R)-四氫呋喃-2-甲酸丁酯對(duì)映體過量值ee_p可達(dá)70%。以外消旋的四氫呋喃-2-甲酸甲酯為底物,篩選能立體選擇性水解該底物的脂肪酶,最終篩選出來源于米曲霉的脂肪酶具有高選擇性,該酶優(yōu)先水解(S)-四氫呋喃-2-甲酸甲酯,留下光學(xué)純的(R)-四氫呋喃-2-甲酸甲酯。該酶催化水解四氫呋喃-2-甲酸甲酯的最佳條件為:磷酸鹽緩沖液(pH7.0,0.2 M),溫度30℃,當(dāng)?shù)孜餄舛葹?.1 mol/L,加酶量為20 g/L時(shí),反應(yīng)52 h,轉(zhuǎn)化率為74%,底物(R)-四氫呋喃-2-甲酸甲酯的ee_s為100%。對(duì)酶進(jìn)行固定化可提高酶的催化活力,且使酶可重復(fù)使用。酶的固定化的方法很多,論文使用吸附法對(duì)米曲霉脂肪酶進(jìn)行固定化實(shí)驗(yàn)。對(duì)大孔吸附樹脂和離子交換樹脂對(duì)米曲霉脂肪酶進(jìn)行固定化研究,其中陰離子交換樹脂Q為理想的固定化載體。在磷酸鹽緩沖液中(pH7.0,0.02 M),加酶量為30 g/L,Q加量為200 g/L,30℃條件下,吸附5 h左右可將酶蛋白全部固定在樹脂上。固定化酶的催化效率較游離酶有了大幅度提升,且保留了游離酶的立體選擇性。底物濃度為0.1 mol/L,固定化酶的加酶量為100 g/L,在磷酸鹽緩沖液(pH7.0,0.1 M)中,30℃進(jìn)行水解反應(yīng)的催化5 h,底物對(duì)映體過量ee_s可達(dá)99.1%,轉(zhuǎn)化率76.3%。在對(duì)固定化酶進(jìn)行回收后再進(jìn)行催化反應(yīng),回收10次左右該固定化酶依然能保持較高的活性和選擇性。
【學(xué)位授予單位】：浙江工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ251.1
【圖文】：

圖 1-4 脂肪酶催化水解布洛芬酯示意圖[41]Fig.1-4 Schematic diagram of the lipase-catalyzed membrane reactor for DKR ofibuprofen ester(2S,3R)-2-甲基-1-乙酰吡啶-2,3-二羧酸酯，是合成莫西沙星的中間體。Perla等[42]使用游離南極假絲酵母（C. antarctica）脂肪酶 B（CAL-B）對(duì)其進(jìn)行水解，反應(yīng) 16 h，轉(zhuǎn)化率為 53%，對(duì)映體過量值 ees> 99%，對(duì)映體選擇率 E 可達(dá) 80。NOCOOMeCOOMeCAL BBuffer , pH 7.5NOCOOMeCOOH NOCOOMeCOOMecis-(±)圖 1-5 CAL-B 拆分(2S,3R)-2-甲基-1-乙酰吡啶-2,3-二羧酸酯[42]Fig.1-5 CAL-B resolution (2S, 3R)-2-methyl-1-acetylpyridine-2,3-dicarboxylate

映體過量（公式（1）），C 表示底物的轉(zhuǎn)化率（公式（2）），E 表示酶的光學(xué)選擇性（公式（3））。eep= ([S] - [R]) / ([S] + [R])×100% (1)C = (C0- Ct) / C0×100% (2)E = ln[(1 - C)(1 - eep)]/ln[(1 - C)(1 + eep)] (3)公式中[S]和[R]表示(S)-構(gòu)型酯以及(R)-構(gòu)型酯的峰面積，C0表示底物的初始濃度（M），Ct表示反應(yīng)后底物的濃度（M）。2.4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與討論2.4.1 四氫呋喃-2-甲酸濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線因酯化反應(yīng)是在非水相環(huán)境中進(jìn)行，為方便檢測(cè)，亦使用 GC 法對(duì)底物四氫呋喃-2-甲酸的濃度進(jìn)行檢測(cè)，根據(jù) 2.3.4②的方法分析四氫呋喃-2-甲酸的色譜圖如圖 2-1 所示。

圖 2-3 四氫呋喃-2-甲酸正丁酯氣相色譜圖Fig.2-3 Gas chromatogram of N-butyl tetrahydrofuran-2-carboxylate通過對(duì)實(shí)驗(yàn)室已購買的各類商品酶以及從浙江、安徽、河南等地采集的 500多份土壤中分離的菌種發(fā)酵凍干粉進(jìn)行了初篩，即使用商品酶或凍干菌粉催化酯化四氫呋喃-2-甲酸。計(jì)算反應(yīng)結(jié)束后產(chǎn)物四氫呋喃-2-甲酸酯的對(duì)映體過量 eep、轉(zhuǎn)化率及 E 值。通過實(shí)驗(yàn)篩選出四種對(duì)四氫呋喃-2-甲酸的酯化具有較高活性和選擇性的酶。結(jié)果如表 2-3。其中，Novozym 435 脂肪酶的光學(xué)選擇性最好，E值為 5.62。因此選擇使用 Novozyme 435 脂肪酶做進(jìn)一步試驗(yàn)。表 2-3 四氫呋喃-2-甲酸酯化脂肪酶篩選結(jié)果Table 2-3 The screening of lipase for enantioselective esterification of 2-tetrahydrofuroic acid脂肪酶反應(yīng)時(shí)間eep（%） 轉(zhuǎn)化率（%） E

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2777404