【摘要】：本文以新鮮刺參(Apostichopus japonicas)腸道為原材料,以多肽粗提物得率和抗菌活性為指標,采用甲醇浸提法和乙酸溶液浸提法提取仿刺參腸道中的多肽。選用單因素以及正交實驗法優(yōu)化提取參數(shù),得到浸提參數(shù)的最佳值。采用切向流膜包超濾技術(shù)制備出4組不同分子量范圍的多肽,并檢測其對大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的抗菌活性。使用Sephadex G-25柱層析進行分離純化,并對所得組分抗菌活性進行檢測,最后使用高效液相色譜儀(HPLC)對所得具有抗菌活性的多肽進行分析。實驗結(jié)果如下:1.刺參腸道抗菌肽的提取方法和工藝條件的優(yōu)化以粗提物得率為指標,采用單因素和正交試驗對甲醇和乙酸浸提法進行優(yōu)化,所得最佳提取條件,甲醇浸提法為:料液比0.3 g/mL、浸提液濃度80%、浸提時間24h、離心轉(zhuǎn)速8000 r/min,正交所能取得的最高得率為8.33%。乙酸浸提法為:料液比0.2 g/mL、浸提液濃度7%、浸提時間24 h、離心轉(zhuǎn)速8000 r/min。正交所能取得的最高得率為7.41%。粗提物多肽含量測定結(jié)果:甲醇組為3.26 mg/mL,乙酸組為2.62 mg/mL。2.粗提物超濾結(jié)果分析及抗菌活性的測定采用切向流超濾系統(tǒng)將甲醇和乙酸粗提物分別分成4個分子量多肽組,分別為:1kD、1~3kD、3~5kD、5~10kD,發(fā)現(xiàn)3kD以上組需通過4次超濾方可將不同分子量大小的多肽分開,3kD以下組則需要至少5次超濾才能將不同分子量的多肽分開。采用比濁法測試甲醇和乙酸超濾組不同分子量組的多肽對7種細菌的抑菌活性,繪制各個細菌24 h的生長曲線,得到各分子量組多肽的抗菌活性。結(jié)果表明:小于1kD的甲醇超濾組多肽在甲醇和乙酸各分子量超濾多肽組中的抑菌譜最廣,抗菌活性最強。3.葡聚糖凝膠G-25層析純化分析及抗菌活性測定對超濾后抗菌活性最強樣品組進行Sephadex G-25層析純化,經(jīng)洗脫得到3種成分,分別記為P1、P2、P3。對得到的3種洗脫成分使用抑菌圈法和比濁法進行抗菌活性的測定,結(jié)果表明:P2對大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌和鰻弧菌的抑菌圈直徑為16.5 mm、15.7 mm、14.6 mm、13.9 mm、15.1mm,最低抑菌濃度(MIC)為1000μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、3000μg/mL、2000μg/mL,P1與P3無抗菌活性。同時,分析了加熱時長、加熱溫度及凍融次數(shù)對P2抗菌活性的影響,結(jié)果顯示:加熱時長及溫度對P2影響不顯著,凍融次數(shù)對P2影響顯著;Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示:P2在分離膠上為單一條帶,分子量為4.5kD;最后通過HPLC對P2成分進行分析,結(jié)果顯示P2由5種物質(zhì)構(gòu)成。
【學位授予單位】：煙臺大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ914.2
【圖文】：

7圖 1-1 抗菌肽抑菌機理模型[70]Fig.1-1 Antibacterial mechanism of antimicrobial peptide1.4 抗菌肽純化方法研究目前，國內(nèi)外分離、純化海洋生物活性肽方法主要有切向流超濾技術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)等。根據(jù)層析柱中填料和樣品在通過填料時分配、交換的原理不同，層析方法包括凝膠層析、親和層析、疏水層析和離子交換層析等[71,72]。層析時所用填料主要有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和硅膠顆粒等。

本研究的技術(shù)路線

將樣品通過 0.22μm 水相濾膜過濾，去除雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱；分別配制流動相 A：0.1%三氟乙酸（TFA）和流動相 B：乙腈，并分別通過 0.22 μm 水相濾膜和有機濾膜除雜，并使用超聲波清洗器對流動相進行脫氣處理，防止其中的氣泡對結(jié)果產(chǎn)生影響。2）色譜柱首先通過 A 液進行平衡，待基線穩(wěn)定后，用微量注射器進樣 20 μL，0-10min，B 液從 0-30%，10-30 min，B 液從 30%-90%，控制流速 1 mL/min，柱溫 35 ℃，檢測波長為 214 nm。待洗脫完畢后，將導出結(jié)果并分析。4.3 結(jié)果分析4.3.1 Sephadex G-25 層析分離純化結(jié)果分析將分子量＜1kD 的多肽配制成 25 mg/mL 的溶液，過 0.22 μm 濾膜，離心上樣。使用 0.5%甲醇做洗脫劑，洗脫流速為 0.5 mL/min，每 6 min 收集一管，觀察圖 4-1洗脫分離結(jié)果：共收集到 50 管洗脫液，經(jīng) 280 nm 下紫外檢測后出現(xiàn) 3 個洗脫峰，分別記為 P1、P2 和 P3。下一步，對所得三種組分進行抗菌活性的測定。

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 彭瑞華;;頭孢菌素的“世代”觀[J];湖北醫(yī)藥導報;1987年02期

2 劉鵬;;氧氟沙星(Ofloxacin)[J];國外醫(yī)藥.合成藥.生化藥.制劑分冊;1987年05期

3 HAROLDC.NEU.M.D;劉華珍;;抗菌活性、細菌耐藥性和抗菌藥理學使用新藥劑能否收到費用效益?[J];微生物學雜志;1987年04期

4 毛培宏;;用L-干燥法和瓊脂移植法保藏的放線菌的抗菌活性[J];國外藥學(抗生素分冊);1987年02期

5 虞瑞堯;;硫康唑抗菌活性和對淺部真菌病療效復習[J];皮膚病防治;1987年Z2期

6 林赴田;;氟喹諾酮類抗菌劑的進展[J];天津醫(yī)藥;1987年10期

7 王瑞綿;戎誠興;張世明;葉漢增;鄭哲紅;孟運蓮;黃宜基;;賴氨酸月桂基酯在小鼠活體內(nèi)抗菌活性的研究[J];湖北醫(yī)學院學報;1987年01期

8 鄭天凌;小定鞭金藻的抗菌活性研究[J];廈門大學學報(自然科學版);1988年02期

9 郭惠元,孫蘭英,湯云,閻桂華,張致平;吡酮酸類抗菌藥物的研究——Ⅵ.7-氯-6-氟-1-乙基-1,4-二氫-4-氧吡啶(2,3-c)并噠嗪-3-羧酸及其衍生物的合成與抗菌活性[J];藥學學報;1988年08期

10 王玉芬,王浴生;Ceftazidime的抗菌活性、藥代動力學特性及臨床應(yīng)用[J];國外藥學(抗生素分冊);1988年01期

相關(guān)會議論文 前10條

1 肖國強;殷霞;胡志鵬;尹曉剛;陳春霞;鄢明;;3-硝基-2H-色烯的合成和抗菌活性研究[A];2011年全國藥物化學學術(shù)會議——藥物的源頭創(chuàng)新論文摘要集[C];2011年

2 王婷;鄒馮;張淑華;;國產(chǎn)磷酸特地唑胺的體內(nèi)外抗菌活性[A];中國藥理學會第十三屆全國化療藥理學術(shù)研討會會議論文集[C];2016年

3 于克貴;李東紅;周成合;刁俊林;;新型陽離子卟啉的合成及抗菌活性研究[A];中國化學會第26屆學術(shù)年會化學生物分會場論文集[C];2008年

4 欽傳光;張瑞潔;牛衛(wèi)寧;徐春蘭;尚曉婭;任錦;;脂肪酰陽離子肽的設(shè)計合成及其抗菌活性研究[A];第六屆全國化學生物學學術(shù)會議論文摘要集[C];2009年

5 李虹;趙暉;;人精漿抗菌活性及精漿小分子抗菌肽的研究[A];第十五屆全國泌尿外科學術(shù)會議論文集[C];2008年

6 周偉良;余愛珍;;左氧氟沙星體內(nèi)、外抗菌活性[A];中國藥理學會第九屆制藥工業(yè)藥理學術(shù)會議論文摘要匯編[C];2000年

7 劉佳萌;庹利;董艷萍;郭琳;旭格拉 哈布丁;陳川;李昕;朱霞琳;曹存巍;孫承航;;塔克拉瑪干沙漠南麓沙生植物內(nèi)生放線菌抗菌活性篩選[A];第五屆全國微生物資源學術(shù)暨國家微生物資源平臺運行服務(wù)研討會論文摘要集[C];2013年

8 劉文強;劉翼翔;;麒麟菜硫酸多糖的提取及抗菌活性的研究[A];中國食品科學技術(shù)學會第十五屆年會論文摘要集[C];2018年

9 盧衛(wèi)紅;朱峰;劉漢基;;朱紅栓菌活性物質(zhì)的提取及其抗菌活性研究[A];全國動物生理生化第十二次學術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2012年

10 陳肖卓;許蓬;雷平生;;含硫醚側(cè)鏈大環(huán)內(nèi)酯衍生物的合成及其抗菌活性研究[A];中國化學會第27屆學術(shù)年會第06分會場摘要集[C];2010年

相關(guān)重要報紙文章 前10條

1 麥國榮;第四代喹諾酮類藥物研究[N];中國醫(yī)藥報;2000年

2 山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學院 楊瑞鋒;用精準“組方”攻克禽“頑疾”[N];中國畜牧獸醫(yī)報;2007年

3 吳志 羅金財;沙星，“帶刺”的抗菌明星？[N];科技日報;2013年

4 記者 宋翩 通訊員 劉慧嬋 祝和平;華南理工大學學生找出熟肉保鮮方案[N];大眾科技報;2011年

5 ;頭孢菌素類抗生素的應(yīng)用（一）[N];農(nóng)村醫(yī)藥報（漢）;2007年

6 商報記者 楊帆;最奢侈蜂蜜的“數(shù)字化”創(chuàng)意[N];北京商報;2009年

7 高河;頭孢喹肟[N];江蘇農(nóng)業(yè)科技報;2009年

8 全科執(zhí)業(yè)醫(yī)師、執(zhí)業(yè)藥師 尹鐵民;解密阿莫西林克拉維酸鉀配比[N];醫(yī)藥經(jīng)濟報;2009年

9 劉默　劉穎 劉登科;改造結(jié)構(gòu) 降低耐藥[N];中國醫(yī)藥報;2007年

10 本報記者 羅中云;中國學者《自然》論文被指造假[N];北京科技報;2006年

相關(guān)博士學位論文 前10條

1 代江坤;Harman等β-咔啉系列抗菌衍生物的設(shè)計合成及其作用機制[D];西北農(nóng)林科技大學;2019年

2 周義文;家蠅抗菌肽分離純化抗菌活性及分子結(jié)構(gòu)研究[D];重慶醫(yī)科大學;2004年

3 陸志科;竹葉生物活性成分提取分離及其抗菌活性研究[D];中南林學院;2004年

4 劉開湘;7-[（1S，4S）-3，3-二甲基-2-氧雜-5-氮雜二環(huán)[2.2.1]庚烷基]-喹諾酮及其類似物的合成及抗菌活性的研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2002年

5 韓紅娜;青霉烯類抗生素法羅培南與酯型新化合物的合成及抗菌活性研究[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2001年

6 胡來興;美羅培南的合成研究與1，3，4-噻二唑碳青霉烯類新化合物的合成及抗菌活性測定[D];中國協(xié)和醫(yī)科大學;2000年

7 路福平;無抗菌活性放線菌的激活和抗生素篩選新方法的研究[D];華南理工大學;1996年

8 黃勛;無機抗菌復合材料的制備、抗菌活性及其抗菌機理研究[D];中南大學;2007年

9 枚春成（MAI XUAN THANH）;二級結(jié)構(gòu)對抗菌肽的抗菌活性及特異性的影響[D];吉林大學;2013年

10 李濤;PMMA骨水泥的生物活性和抗菌活性研究[D];北京協(xié)和醫(yī)學院;2014年

相關(guān)碩士學位論文 前10條

1 李文茜;抗菌多肽修飾銀納米粒的抗菌活性研究[D];鄭州大學;2019年

2 楊靜;抗菌肽Dermaseptin B2、改造肽表達體系的構(gòu)建和抗菌活性比較研究[D];蘭州大學;2019年

3 陶騰州;刺參腸道源抗菌肽的分離、純化及抗菌活性研究[D];煙臺大學;2019年

4 李衍荷;紅樹林真菌多色青霉和細孢枝孢菌以及蘄艾次級代謝產(chǎn)物及其抗菌活性研究[D];中國科學院大學(中國科學院海洋研究所);2017年

5 劉鈺穎;金屬配合物線粒體成像和抗菌活性研究[D];廣東藥科大學;2018年

6 王蕾;獼猴桃多肽的制備工藝及其抗菌活性的研究[D];西北大學;2018年

7 段欣冉;高通量篩選平臺用于清熱解毒中藥的體內(nèi)抗菌活性研究[D];廣東藥科大學;2018年

8 劉敬如;基于FtsZ的二氫喹唑啉和菲啶類衍生物的設(shè)計、合成和抗菌活性研究[D];山東大學;2018年

9 謝承成;載萬古霉素、亞胺培南西司他丁、莫西沙星骨水泥的洗脫特性及抗菌活性的體外實驗研究[D];昆明醫(yī)科大學;2018年

10 倪賽;抗菌活性微生物的篩選、鑒定及其次級代謝產(chǎn)物的初步研究[D];江西農(nóng)業(yè)大學;2018年

本文編號：2775742