【摘要】：本文以新鮮刺參(Apostichopus japonicas)腸道為原材料,以多肽粗提物得率和抗菌活性為指標(biāo),采用甲醇浸提法和乙酸溶液浸提法提取仿刺參腸道中的多肽。選用單因素以及正交實(shí)驗(yàn)法優(yōu)化提取參數(shù),得到浸提參數(shù)的最佳值。采用切向流膜包超濾技術(shù)制備出4組不同分子量范圍的多肽,并檢測(cè)其對(duì)大腸埃希氏菌(Escherichia coli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)、蠟樣芽孢桿菌(Bacillus cereus)、鰻弧菌(Vibrio anguillarum)、副溶血弧菌(Vibrio Parahaemolyticus)和哈維氏弧菌(Vibrio harveyi)的抗菌活性。使用Sephadex G-25柱層析進(jìn)行分離純化,并對(duì)所得組分抗菌活性進(jìn)行檢測(cè),最后使用高效液相色譜儀(HPLC)對(duì)所得具有抗菌活性的多肽進(jìn)行分析。實(shí)驗(yàn)結(jié)果如下:1.刺參腸道抗菌肽的提取方法和工藝條件的優(yōu)化以粗提物得率為指標(biāo),采用單因素和正交試驗(yàn)對(duì)甲醇和乙酸浸提法進(jìn)行優(yōu)化,所得最佳提取條件,甲醇浸提法為:料液比0.3 g/mL、浸提液濃度80%、浸提時(shí)間24h、離心轉(zhuǎn)速8000 r/min,正交所能取得的最高得率為8.33%。乙酸浸提法為:料液比0.2 g/mL、浸提液濃度7%、浸提時(shí)間24 h、離心轉(zhuǎn)速8000 r/min。正交所能取得的最高得率為7.41%。粗提物多肽含量測(cè)定結(jié)果:甲醇組為3.26 mg/mL,乙酸組為2.62 mg/mL。2.粗提物超濾結(jié)果分析及抗菌活性的測(cè)定采用切向流超濾系統(tǒng)將甲醇和乙酸粗提物分別分成4個(gè)分子量多肽組,分別為:1kD、1~3kD、3~5kD、5~10kD,發(fā)現(xiàn)3kD以上組需通過4次超濾方可將不同分子量大小的多肽分開,3kD以下組則需要至少5次超濾才能將不同分子量的多肽分開。采用比濁法測(cè)試甲醇和乙酸超濾組不同分子量組的多肽對(duì)7種細(xì)菌的抑菌活性,繪制各個(gè)細(xì)菌24 h的生長曲線,得到各分子量組多肽的抗菌活性。結(jié)果表明:小于1kD的甲醇超濾組多肽在甲醇和乙酸各分子量超濾多肽組中的抑菌譜最廣,抗菌活性最強(qiáng)。3.葡聚糖凝膠G-25層析純化分析及抗菌活性測(cè)定對(duì)超濾后抗菌活性最強(qiáng)樣品組進(jìn)行Sephadex G-25層析純化,經(jīng)洗脫得到3種成分,分別記為P1、P2、P3。對(duì)得到的3種洗脫成分使用抑菌圈法和比濁法進(jìn)行抗菌活性的測(cè)定,結(jié)果表明:P2對(duì)大腸埃希氏菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、副溶血弧菌和鰻弧菌的抑菌圈直徑為16.5 mm、15.7 mm、14.6 mm、13.9 mm、15.1mm,最低抑菌濃度(MIC)為1000μg/mL、1000μg/mL、2000μg/mL、3000μg/mL、2000μg/mL,P1與P3無抗菌活性。同時(shí),分析了加熱時(shí)長、加熱溫度及凍融次數(shù)對(duì)P2抗菌活性的影響,結(jié)果顯示:加熱時(shí)長及溫度對(duì)P2影響不顯著,凍融次數(shù)對(duì)P2影響顯著;Tricine-SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示:P2在分離膠上為單一條帶,分子量為4.5kD;最后通過HPLC對(duì)P2成分進(jìn)行分析,結(jié)果顯示P2由5種物質(zhì)構(gòu)成。
【學(xué)位授予單位】：煙臺(tái)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ914.2
【圖文】：

7圖 1-1 抗菌肽抑菌機(jī)理模型[70]Fig.1-1 Antibacterial mechanism of antimicrobial peptide1.4 抗菌肽純化方法研究目前，國內(nèi)外分離、純化海洋生物活性肽方法主要有切向流超濾技術(shù)、層析技術(shù)、電泳技術(shù)等。根據(jù)層析柱中填料和樣品在通過填料時(shí)分配、交換的原理不同，層析方法包括凝膠層析、親和層析、疏水層析和離子交換層析等[71,72]。層析時(shí)所用填料主要有葡聚糖凝膠、瓊脂糖凝膠和硅膠顆粒等。

本研究的技術(shù)路線

將樣品通過 0.22μm 水相濾膜過濾，去除雜質(zhì)，防止堵塞色譜柱；分別配制流動(dòng)相 A：0.1%三氟乙酸（TFA）和流動(dòng)相 B：乙腈，并分別通過 0.22 μm 水相濾膜和有機(jī)濾膜除雜，并使用超聲波清洗器對(duì)流動(dòng)相進(jìn)行脫氣處理，防止其中的氣泡對(duì)結(jié)果產(chǎn)生影響。2）色譜柱首先通過 A 液進(jìn)行平衡，待基線穩(wěn)定后，用微量注射器進(jìn)樣 20 μL，0-10min，B 液從 0-30%，10-30 min，B 液從 30%-90%，控制流速 1 mL/min，柱溫 35 ℃，檢測(cè)波長為 214 nm。待洗脫完畢后，將導(dǎo)出結(jié)果并分析。4.3 結(jié)果分析4.3.1 Sephadex G-25 層析分離純化結(jié)果分析將分子量＜1kD 的多肽配制成 25 mg/mL 的溶液，過 0.22 μm 濾膜，離心上樣。使用 0.5%甲醇做洗脫劑，洗脫流速為 0.5 mL/min，每 6 min 收集一管，觀察圖 4-1洗脫分離結(jié)果：共收集到 50 管洗脫液，經(jīng) 280 nm 下紫外檢測(cè)后出現(xiàn) 3 個(gè)洗脫峰，分別記為 P1、P2 和 P3。下一步，對(duì)所得三種組分進(jìn)行抗菌活性的測(cè)定。

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