【摘要】：表面活性素(surfactin)是來自于微生物的脂肽類次級代謝產物,具有優(yōu)良的表面活性和乳化性,是一種良好的生物表面活性劑。此外表面活性素一般還具有抗菌、抗病毒和抗癌等生物活性,因此在食品工業(yè)、醫(yī)藥行業(yè)和環(huán)境修復等領域有著廣泛的應用價值。但是天然菌株產生表面活性素的能力通常很低,限制了其在生產中的應用,因此通過誘變菌株提高表面活性素的產量有著十分重大的意義。本研究首先利用常壓室溫等離子體(Atmospheric and Room Temperature Plasma,ARTP)誘變枯草芽孢桿菌,篩選高產表面活性素的突變株,并采用基因組學等方法初步研究其誘變機制;其次,對突變株的發(fā)酵工藝分別進行單因素和響應面優(yōu)化試驗,獲得最優(yōu)發(fā)酵工藝條件;對最優(yōu)發(fā)酵工藝條件下突變株發(fā)酵產生的表面活性素進行提取,鑒定其結構,并研究其功能特性。本文的主要研究內容及結果如下:(1)ARTP誘變選育高產表面活性素菌株的研究。根據表面活性素產量從6株芽孢桿菌中通過對比選擇枯草芽孢桿菌CICC 10721為出發(fā)菌株,其表面活性素產量為0.73 mg/mL,利用ARTP對其進行誘變育種,結果表明在誘變時間24 s、功率100 W、載氣量10 SLM(標況下升每分鐘,Standard Litre per Minute)的條件下,ARTP對菌株致死率為92.21%。在該條件下以溶血圈初篩、搖瓶發(fā)酵復篩的方法篩選獲得突變菌株M45,其溶血圈直徑與菌落直徑比值達到6.11,表面活性素產量相對出發(fā)菌株提高了35.6%,達到0.99mg/L且傳代穩(wěn)定。通過對比出發(fā)菌株和突變菌株的發(fā)酵動力學參數,發(fā)現(xiàn)突變菌株M45的最大菌體干重、最大生長速率以及產物表面活性素合成參數等均大于出發(fā)菌,說明突變菌株M45的生長性能和發(fā)酵產表面活性素性能均高于出發(fā)菌株。(2)對ARTP誘變枯草芽孢桿菌CICC 10721的機制進行初步研究。首先,通過掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)ARTP誘變處理后的菌體形態(tài)發(fā)生改變,出現(xiàn)彎曲、突出、凹陷、變長以及破損等現(xiàn)象,另外,誘變后的菌體胞內鈣離子濃度顯著增加,說明ARTP處理改變了枯草芽孢桿菌細胞膜的通透性。通過基因組重測序分析,發(fā)現(xiàn)突變株M45相對于出發(fā)菌株發(fā)生了66個SNP非同義突變位點,涉及到30個基因,將差異基因編碼的氨基酸序列分別在GO(Gene Ontology)、KEGG(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes)、eggNOG(evolutionary genealogy of genes:Non-supervised Orthologous Groups)數據庫中進行比對,發(fā)現(xiàn)差異基因中dltC、ytrC和ycbP等與膜組成相關,OTC、argF和argI基因與氨基酸轉運和代謝相關,argF、yobL和pbpA基因與有機酸的結合與代謝有關,fevC、ytrC、secDF和agG基因涉及到細胞膜轉運。(3)以表面活性素產量為主要評價指標,對突變菌株M45進行了發(fā)酵工藝的優(yōu)化。單因素試驗結果表明,影響表面活性素產量的主要因素是初始pH值、接種量和葡萄糖含量,通過響應面優(yōu)化試驗后得到最優(yōu)發(fā)酵工藝條件為:葡萄糖含量4.35%(W/V)、硝酸銨含量0.8%(W/V)、接種量4.68%(V/V)、初始pH值7.14、發(fā)酵溫度30℃、搖床轉速180 r/min,在此條件下,表面活性素產量為2.15 mg/mL,相比優(yōu)化前提高了148%。(4)對突變菌株M45產生的表面活性素進行了結構鑒定和功能特性的研究。高效液相色譜分析發(fā)現(xiàn)從發(fā)酵液提取的表面活性素純度達到89.3%,通過氨基酸組成分析和液相色譜-質譜聯(lián)用分析等發(fā)現(xiàn)其中主要的表面活性素類型有:C_(12)2 surfactin、C_(13)3 surfactin、C_(14)4 surfactin、C_(15)5 surfactin和C_(16)6 surfactin。對表面活性素提取物的表面活性、乳化性、抗氧化性等研究發(fā)現(xiàn):表面活性素提取物的臨界膠束濃度約為0.1 mg/mL,該濃度下溶液表面張力比對照組降低56%;5mg/mL的表面活性素提取物溶液乳化指數即可達75%,且在5 d后僅下降2.7%;提取物對1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl,DPPH)自由基清除的IC_(50)濃度為4.42 mg/mL。研究表面活性素提取物對結腸癌細胞(Caco-2)、肝癌細胞(HepG2)和宮頸癌細胞(Hela)增殖的抑制效應,發(fā)現(xiàn)表面活性素提取物對三種癌細胞增殖均具有顯著的抑制作用,其作用24 h后抑制增殖的IC_(50)濃度分別為293.11、90.94和81.67μg/mL。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ423;TQ920.6
【圖文】：

其中表面活性素是發(fā)現(xiàn)最早且生物表面活性最域具有廣泛的應用價值而備受關注[5,6]。從枯草芽孢桿菌的培養(yǎng)液中首次發(fā)現(xiàn)表面活性素，由七肽上第 7 個氨基酸殘基通過內酯鍵與 12接而成，其結構如圖 1.1 所示[8]。表面活性素的6 和 7 位；而親水性谷氨酸和天冬氨酸位于第 1。表面活性素的同分異構體在相同位置上的氨，其異構體 A/B/C 的第七位氨基酸分別為亮氨其獨特的結構，表面活性素是一種非常強大的力從 72 mN/m 降低至 27 mN/m，同時具有較好面活性素還具有抗菌活性，但沒有明顯的殺菌性素具有抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和抑制酶等活

M43 M80 M101 M116 M156 M1730.00.20.40.60.8面活性素產量（表gmmL/菌株編號對照圖 2.6 復篩菌株中的表面活性素產量Fig. 2.6 surfactin yield of secondary screening strains產表面活性素傳代穩(wěn)定性結果.7 中復篩出的 M36、M38、M45、M56、M77、M79和 M量提高較明顯的菌株進行產表面活性素傳代穩(wěn)定性試驗穩(wěn)定性有一定的差異，結果如圖 2.7所示。

江蘇大學碩士學位論文示，其中 A1、A2 為對照組，B1、B2 為 ARTP 處理組，可以看出對照組菌體形狀規(guī)則，細胞膜無破損現(xiàn)象，正處于分裂過程。ARTP 處理后的菌體發(fā)生以下幾種變化：一些細胞形狀發(fā)生不同程度的彎曲、突出、凹陷和變長，一些細胞有破裂的情況，說明 ARTP 發(fā)射的等離子流對枯草芽孢桿菌 CICC 10721的細胞膜有一定的刺激作用，導致細胞形態(tài)的改變，一些不耐受菌會直接破裂死亡，而一些抗性較強的菌則會發(fā)生不同的改變并存活下來，其生長增殖可能因而受到促進。

【參考文獻】

相關期刊論文 前10條

1 王國正;吳群;徐巖;;低產高級醇釀酒酵母突變菌株的差異蛋白組分析及高級醇合成相關蛋白的差異表達[J];微生物學通報;2015年12期

2 陳亮;毛晶晶;宇光海;王金水;卞科;;響應面法優(yōu)化Bacillus subtilis抗菌脂肽發(fā)酵工藝條件[J];食品科技;2015年04期

3 何榮海;劉磊;蔣邊;翟慶嬌;馬海樂;;枯草芽孢桿菌液態(tài)發(fā)酵菜籽粕制備抗氧化肽[J];中國食品學報;2013年12期

4 韋獻雅;殷麗琴;鐘成;章明海;牛應澤;;DPPH法評價抗氧化活性研究進展[J];食品科學;2014年09期

5 黃翔峰;詹鵬舉;彭開銘;劉佳;陸麗君;;培養(yǎng)基中鐵離子對枯草芽孢桿菌CICC 23659發(fā)酵產脂肽的影響研究[J];中國生物工程雜志;2013年06期

6 馬勇;圖雅;陳秀莉;門中華;;分光光度法測定高濃度培養(yǎng)液下的產油酵母菌生長曲線[J];北方園藝;2013年08期

7 趙川;羅建軍;陳少華;胡美英;;微生物菌種改良篩選新技術研究進展[J];生物技術通報;2009年S1期

8 艾嘉;陸兆新;別小妹;呂鳳霞;袁勇軍;黃現(xiàn)青;;高效液相色譜法測定發(fā)酵液中表面活性素的含量[J];食品科學;2009年06期

9 孫力軍;陸兆新;別小妹;呂鳳霞;方傳記;;培養(yǎng)基對解淀粉芽孢桿菌ES-2菌株產抗菌脂肽的影響[J];中國農業(yè)科學;2008年10期

10 別小妹;陸兆新;;影響枯草芽孢桿菌fmbR菌株抗菌物質提取的主要因子[J];南京農業(yè)大學學報;2005年04期

相關博士學位論文 前5條

1 郅巖;芽孢桿菌高效合成表面活性素的代謝機制及功能研究[D];江南大學;2017年

2 莊國宏;產抗菌脂肽GD菌株篩選及脂肽分離、鑒定與應用研究[D];揚州大學;2014年

3 錢靜亞;脈沖磁場對枯草芽孢桿菌的滅活作用及其機理研究[D];江蘇大學;2013年

4 趙君峰;淀粉液化芽孢桿菌ES-2-4基因組改組提高脂肽產量及其突變菌株差異蛋白組學分析[D];南京農業(yè)大學;2012年

5 丁立孝;脂肽生物表面活性劑的發(fā)酵生產及其結構、性質研究[D];浙江大學;2004年

相關碩士學位論文 前8條

1 崔彥茹;Paenibacillus Polymyxa SC2的ARTP誘變及其突變株的基因組與轉錄組測序分析[D];山東農業(yè)大學;2017年

2 李頌碩;解淀粉芽孢桿菌S3-1的田間應用及表面活性素發(fā)酵工藝優(yōu)化[D];上海師范大學;2017年

3 邢歡;低強度超聲波對熱帶假絲酵母的促增殖效應及其機制研究[D];江蘇大學;2016年

4 田海嬌;纖維素酶生產菌的篩選、誘變及產酶機制的初步研究[D];東北林業(yè)大學;2015年

5 李猛;去甲斑蝥素誘導結腸癌LS-174T細胞凋亡及其作用機制[D];河北醫(yī)科大學;2014年

6 丁嵐;產金黃色葡萄球菌腸毒素A工程菌構建及其發(fā)酵條件研究[D];華中農業(yè)大學;2010年

7 朱海東;新型抗真菌抗生素發(fā)酵工藝的優(yōu)化及其產物提取分離的初步研究[D];浙江工業(yè)大學;2005年

8 陳蓉明;生物表面活性素高產菌UN1101的選育和理化性質的研究[D];福建師范大學;2001年

本文編號：2759290