【摘要】：1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一種重要的化學品,在食品、藥品、化工等領域具有廣泛應用。微生物合成法是一種成本低廉、環(huán)境友好的新型合成方法,但天然的1,3-PD生產(chǎn)菌株都面臨產(chǎn)物耐受性低、副產(chǎn)物對原菌的毒性等問題。Clostridium butyricum作為其中一種生產(chǎn)菌株,具有菌種為益生菌和不需要昂貴輔酶添加的優(yōu)勢。本研究針對C.butyricum轉化甘油生產(chǎn)1,3-PD中的產(chǎn)物低耐受性問題,對原始菌株進行了NTG和ARTP相結合的物理化學復合誘變的方法,獲得了一株1,3-PD高耐受菌株;隨后,利用C.butyricum高耐受菌株發(fā)酵生產(chǎn)1,3-PD,優(yōu)化了甘油轉化1,3-PD的條件。最后,對原始株和突變株進行多組學的分析,挖掘與1,3-PD耐受性相關的基因與蛋白,初步驗證部分蛋白質的功能。主要的研究結果如下:(1)采用一系列1,3-PD濃度確定了原始菌株C.butyricum XYB11的初始耐受性,隨后利用NTG和ARTP的物理化學復合誘變,得到了突變株C.butyricum YP855,其1,3-PD耐受性相比原始出發(fā)菌株提高了30.8%。(2)采用單因素法和響應面法對突變株C.butyricum YP855進行1,3-PD分批發(fā)酵條件的優(yōu)化,得到1,3-PD分批發(fā)酵的最佳條件為:甘油濃度81.0 g/L,酵母提取物濃度1.6 g/L,發(fā)酵時間為21.7 h,發(fā)酵溫度為36.7℃。在最佳條件下進行1,3-PD的分批發(fā)酵,得到1,3-PD的最終產(chǎn)量為37.20 g/L,產(chǎn)率為0.51 g/g,生產(chǎn)強度為1.71 g/(L·h),比原始菌株分別提高了29.48%、18%和29%。(3)對C.butyricum XYB11進行了全基因組的測序,預測并注釋了基因結構與功能;將C.butyricum XYB11原始株和突變株進行組學分析,結合全基因組測序結果,由轉錄組學數(shù)據(jù)獲得了差異表達的基因,由蛋白組學數(shù)據(jù)得到了差異表達的蛋白,通過轉錄組學和蛋白組學的聯(lián)合分析,開展了差異基因和差異蛋白的GO類別、KEGG代謝通路等富集分析與比較,并從功能的角度分析關鍵基因和蛋白與C.butyricum的1,3-PD耐受性關系,初步篩選得到7個可能與C.butyricum的1,3-PD耐受性相關的關鍵基因,從而用于后續(xù)基因功能的初步驗證。(4)從C.butyricum XYB11中克隆得到上述的7個關鍵基因,利用無縫克隆技術成功構建了7個重組質粒pET-gene,轉化各個重組質粒,在E.coli中成功表達了這些蛋白,對各個重組菌1,3-PD的耐受性進行了檢測,初步驗證了這些關鍵蛋白的功能,得知組氨酸激酶、ABC轉運器、異檸檬酸脫氫酶和甲基接受化學趨向性蛋白可能與C.butyricum的1,3-PD耐受性相關。結合多組學結果,分析了篩選出的關鍵蛋白與耐受性相關的可能分子機制。
【學位授予單位】：江蘇大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ923
【圖文】：

3-PD 的作為溶劑用途也較廣泛，可以作水基油墨，例如噴墨和絲網(wǎng)油墨，用作食品標記油墨，具有較好的穩(wěn)定性，打印特性優(yōu)良[15]。（5）1,3-PD 是有機合成的重要中間體，可用于各種類型的藥物，如維生素H 和免疫類等藥物的合成，也可作為香料；同時，作為化妝品中的添加物，可作為潤膚劑與保濕劑。因此，開發(fā)經(jīng)濟高效的 1,3-PD 的生產(chǎn)方式對于各項工業(yè)發(fā)展都有重要的意義[16]。目前，合成 1,3-PD 的常規(guī)方法是通過丙烯醛的水合，以及環(huán)氧乙烷的加氫甲�；痆17]，這些化學合成方法無論從經(jīng)濟角度還是生態(tài)角度來看，都具有成本高和環(huán)境不友好等的缺點。由 DuPont 公司開發(fā)的甘油到 1,3-PD 的酶促轉化開創(chuàng)了 1,3-PD 合成的新紀元，迄今為止，許多企業(yè)和科研機構已經(jīng)開發(fā)了許多方法來從粗制或純甘油中生產(chǎn) 1,3-PD，通過優(yōu)化天然菌株或開發(fā)基因工程菌株的方法，可有效提高生物法生產(chǎn) 1,3-PD 的產(chǎn)量，其結構簡式和反應簡式如圖 1.1 所示。

圖 1.2 甘油的代謝通路圖[28]Fig 1.2 Metabolic pathways of glycerol catabolism源宿主的基因工程菌轉化代謝工程技術的發(fā)展，開發(fā)了許多新的工程菌來實現(xiàn) 1,3-PD，大腸桿菌（Escherichia coli）作為最常用的蛋白表達異源宿 1,3-PD 異源宿主生產(chǎn)研究最透徹的系統(tǒng)。將 E. coli 用于 1,3杜邦和 Genencor 公司合作開發(fā)的[30]，底物為葡萄糖，主要通，將釀酒酵母來源的可轉化葡萄糖為甘油的基因和 K. pneum基因克隆到E. coli K12中，同時利用E. coli自有的1,3-PDDH編碼），實現(xiàn)了 1,3-PD 的高效合成，產(chǎn)量達到 130 g/L，實現(xiàn)ng 等[31]采用相似的方法，為了改善 1,3-PD 的工業(yè)生產(chǎn)，在設計了由 clts857 阻遏物調節(jié)的溫度敏感性 λ 噬菌體 PL和 P

將這些標準樣品放入液相色譜儀進樣系統(tǒng)中，分別得到峰面積，運用（Version 2018，OriginLab，US），以濃度為橫軸，以峰面積為縱軸，與峰面積的散點圖，并將散點圖進行線性擬合，得到擬合曲線，即為各標準曲線。再用母液配制一個一定濃度的混合標準樣品，在色譜儀中進以驗證確保四種物質可以在色譜柱中得到很好的分離效果。結果與討論 標準樣品的液相結果及標準曲線將配制好的混標進樣檢測，得到的吸收峰如圖 3.1 所示，由圖可知，四在上述色譜條件下得到了較好的分離。結合各化合物濃度大小和單標樣可知，四種待測化合物在該條件下的保留時間（Rt）依次為：甘油，4.61，5.06 min；1,3-PD，5.92 min；丁酸，6.56 min。

【參考文獻】

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本文編號：2758377