【摘要】：硒是動物、植物和微生物營養(yǎng)中重要的一種微量元素,它的降血壓作用主要是由硒蛋白或硒多肽來體現(xiàn)。茶多肽具有一定的降血壓活性,是介于蛋白質(zhì)和氨基酸之間的肽類,和其他的生物分子相比,具有良好的生物活性和多樣性,并且其安全性更高,降血壓活性更顯著。將硒同茶蛋白多肽有效的結(jié)合起來研究,開發(fā)富硒茶蛋白多肽將會有較高的應(yīng)用價值。本文對富硒茶蛋白和普通不富硒茶蛋白進(jìn)行了提取、純化,富硒堿溶性茶蛋白ACE抑制肽和不富硒茶蛋白ACE抑制肽制備、分離純化及結(jié)構(gòu)進(jìn)行了相關(guān)研究,主要研究結(jié)果如下:(1)茶粉經(jīng)過脫色、去多糖等處理后,在0.1M NaOH,4 mg/ml PVPP,溫度60℃,料液比1:25的條件下提取茶蛋白,Se-TP在洗脫條件下得到四個組分,分別為Se-TPⅠ(Tris-HCl)、Se-TPⅡ(0.2M NaCl)、Se-TPⅢ(0.3M NaCl)、Se-TPⅣ(0.6M NaCl),其中組分Se-TPⅢACE抑制活性較高,為41.3%。而TP在洗脫條件下得到三個組分,分別為TPⅠ(Tris-HCl)、TPⅡ(0.3M NaCl)、TPⅢ(0.5M NaCl),其中組分TPⅢ的ACE抑制活性最高為61.34%。由于隨著蛋白的純化,硒含量下降,另外ACE降血壓活性受蛋白的氨基酸組成、含量、序列的影響,不同條件下層析色譜對蛋白的吸附能力不同,因此,可能導(dǎo)致純化后不富硒蛋白組活性更高。加熱預(yù)處理有利于活性基團(tuán)的暴露,更容易酶解得到活性序列,綜合考慮,選擇預(yù)處理的條件為100℃水浴5min。五種蛋白酶(堿性蛋白酶、中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶)酶解后,檢測各酶解液的ACE抑制活性和水解度,最終選擇堿性蛋白酶和中性蛋白酶進(jìn)行復(fù)合酶解。(2)復(fù)合酶解的單因素實驗顯示:五種因素(p H、溫度、加酶量、反應(yīng)時間,酶比例),在一定范圍內(nèi),酶解產(chǎn)物的活性隨著五因素的遞增,先增后減。五因素對酶解工藝的影響主要體現(xiàn)在對蛋白酶酶活的影響和活性氨基酸的暴露上。復(fù)合酶解的最佳酶解工藝為:最佳酶解條件:pH 8,溫度60℃,加酶量3500U,時間5h,酶比例(堿性:中性)為2:5,普通不富硒堿溶性茶蛋白酶解肽混合物ACE抑制活性IC_(50)為25.95mg/ml,天然富硒堿溶性茶蛋白酶解肽混合物ACE抑制活性IC_(50)為17.07mg/ml。TPep經(jīng)超濾分離得到片四個組分,分別為TPepⅠ(1kDa)、TPepⅡ(1~10 kDa)、TPepⅢ(10~100 kDa)、TPepⅣ(100 kDa),其中組分TPepⅠ(1 kDa)的ACE抑制活性最高,為93.29%。Se-TPep經(jīng)超濾分離得到四個組分,分別為Se-TPepⅠ(1 kDa)、Se-TPepⅡ(1~10 kDa)、Se-TPepⅢ(10~100 kDa)、Se-TPepⅣ(100 kDa),其中組分Se-TPepⅡ(1~10 kDa)的活性最高,為94.78%。超濾所得Se-TPepⅠ和TPepⅠ經(jīng)凝膠Sephadex G-25洗脫均得到兩種組分,且組分Ⅰ含量和ACE抑制活性較高,富硒組分硒含量為2.25PPM,ACE抑制活性IC_(50)為0.93mg/ml,而不富硒組分ACE抑制活性IC_(50)為1.45mg/ml。(3)由電鏡圖可以清晰直觀地看到樣品的外形外貌,天然普通蛋白和多肽片狀形態(tài)更為厚重,而多肽形態(tài)較蛋白而言更為疏松輕薄。蛋白和多肽樣品中均檢測到N-H鍵、O-H鍵、基團(tuán)NH_2、C=O鍵、C-N鍵、芳環(huán)C=C鍵、C-O鍵、C-S鍵等。并且在C-S鍵的位置,天然富硒茶蛋白和多肽樣品的吸收強度增加,可能S被Se取代,受到C-Se鍵的影響。綜合分析,可能是帶有部分芳香族氨基酸的蛋白和多肽。通過Se-TPepⅠ和TPepⅠ的氨基酸組成結(jié)果來看,Se-TPepⅠ中各氨基酸的含量比TPepⅠ要高,并且在N端含有Gly、Ala、Val、Arg等活性氨基酸,其中以Ala、Val的含量最高。C端含有Leu、Tyr、Phe等疏水性氨基酸,其中以Leu的含量最高。且硒主要以硒代半胱氨酸和硒代蛋氨酸的形式與蛋白結(jié)合,而在天然富硒茶多肽樣品中沒有檢測到半胱氨酸,只有蛋氨酸。組分Se-TPep(1k)經(jīng)過NanoLC-Q-TOF-MS分析,得到一條多肽序列AETGEIKGHY,分子量為1103.53。組分Se-TPepⅡ(1~10 kDa)得到兩條多肽序列,其中一條和組分Se-TPep(1k)的多肽完全相同,另外一條多肽序列LGVPIVMHDY,其分子量為1158.57,并且含有硒常結(jié)合的氨基酸Met。組分TPepⅠ(1 kDa)得到一條多肽序列LQPSLGFP,分子量為857.46。
【學(xué)位授予單位】：上海師范大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ936.16
【圖文】：

性茶蛋白的提取、純化及 ACE 抑制活性的研究 上海師范大學(xué)與分析白的蛋白含量及硒含量測定的結(jié)果表 2-5 茶蛋白的蛋白含量及硒含量測定的結(jié)果Table 2-5 Results of Determination of Protein Content andSelenium Content of Tea Protein 硒含量（PPM） 可溶性蛋白含量（%） 總蛋白含 2.82 11.42 白 0.13 10.78 知，根據(jù)考馬斯亮藍(lán)法測定標(biāo)準(zhǔn)蛋白（BSA）制作的+0.0006, R2=0.9999,測定茶蛋白溶液中蛋白質(zhì)含量，其結(jié)

R2=0.9999,測定茶蛋白溶液中蛋白質(zhì)含量，其結(jié)果圖 2-1 考馬斯亮藍(lán)法測蛋白的標(biāo)準(zhǔn)曲線Figure 2-1 Standard curve of Coomassie brilliant blue assay protein度與 Se 熒光強度的標(biāo)準(zhǔn)曲線：Y=0.0111X+0.0929，R2=0.99

圖 2-3 馬尿酸的紫外全波長掃描結(jié)果Figure 2-3 UV full wavelength scan of hippuric acid品 HA 配成 2 mg/ml 在 200 - 600 nm 進(jìn)行紫外的全波長掃描有最強的吸收峰。 的液相結(jié)果L 與 HA 的分離情況l/L 的 HA 標(biāo)準(zhǔn)品在液相下的色譜圖

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本文編號：2758313