發(fā)布時間：2020-07-13 01:57

【摘要】：魷魚是一種具有高蛋白低脂肪特點的水產(chǎn)品,因此利用魷魚制備生物活性肽具有重要的意義。本文選取北太平洋魷魚足和阿根廷魷魚足,利用酶解技術(shù),超濾分級技術(shù)制備具有抗氧化活性和血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme,ACE)抑制活性的多肽,并使用凝膠層析柱分離出魷魚足的小分子量的多肽,進一步探究北太平洋魷魚足多肽和阿根廷魷魚足多肽的抗氧化活性和ACE抑制活性。最后使用計算機方法輔助探索北太平洋魷魚肌球蛋白中具有抗氧化活性和ACE抑制活性的小分子肽。主要研究內(nèi)容如下:(1)魷魚足多肽最佳酶解工藝的研究:以水解度(degree ofhydrolysis,DH)為指標,選用木瓜蛋白酶作為酶解用酶。通過響應面分析實驗發(fā)現(xiàn)添酶量,酶解溫度和液料比三個因素對響應值均具有顯著性影響,得到北太平洋魷魚足最佳酶解條件為添酶量 1.41%(w/w),溫度 51.08℃,液料比 2.26:1(v/v),酶解 6h,DH為 30.16±0.31%。阿根廷魷魚足的最優(yōu)參數(shù)為添酶量1.43%(w/w),溫度50.86℃,酶解6h,液料比2.06:1(v/v),DH為28.98±0.31%。較高DH的魷魚足酶解液(squidprotein hydrolysate,SPH)為后續(xù)實驗提供了基礎(chǔ)。(2)魷魚足多肽分離純化技術(shù)的研究:首先測定了北太平洋SPH和阿根廷SPH的DPPH自由基清除率(20.38±0.97%和18.49±0.7%),羥基自由基清除率(9.35 ±0.57%和 7.75±0.36%),總抗氧化能力(0.070±0.003 U/mL 和 0.376±0.004 U/mL)和ACE抑制能力(45.93±0.31%和42.03±0.19%)用來評價魷魚足SPH的抗氧化活性和ACE抑制活性,實驗結(jié)果顯示北太平洋魷魚足的抗氧化活性和ACE抑制活性均高于阿根廷魷魚足。然后采用超濾分級和Sephadex G-10凝膠層析柱得到SPH-Ⅲ2對DPPH自由基清除力(DPPH自由基清除率分別為25.86±0.59%和25.95±0.56%)和ACE抑制力(ACE抑制率為75.78±0.63%和75.08±0.71%)最高。經(jīng)過UPLC測定,確定北太平洋魷魚SPH-Ⅲ2和阿根廷魷魚足多肽SPH-Ⅲ2的分子量分別為634.84 Da和 637.2 Da。(3)計算機模擬產(chǎn)生北太平洋魷魚抗氧化肽和ACE抑制肽(angiotensin converting enzyme inhibitory peptide,ACEIP)的研究:使用植物蛋白酶和脯氨酰內(nèi)肽酶(prolyloligopeptidase,POP)用于魷魚肌球蛋白重鏈的水解。通過BIOPEP-UWM和ATHpin數(shù)據(jù)庫預測出13種抗氧化肽和126種ACEIP。然后,通過預測毒性,過敏性,胃腸穩(wěn)定性和腸上皮通透性篩選出2種抗氧化肽和30種ACEIP,其中30種ACEIP包括21種已知肽和9種新肽。此外,通過分子對接評估ACEIP與ACE的相互作用機制。結(jié)果表明,ACEIP的新肽中的QY和QM對ACE具有潛在的抑制作用。它們可以通過配位鍵與Zn(IⅡ)結(jié)合,并通過氫鍵和疏水相互作用深埋在ACE的疏水口袋S1、S2和.S1'中。這項工作表明,.北太平洋魷魚是抗氧化肽和ACEIP.的良好來源,也可以用作在計算機中探索食源性抗氧化肽和ACE抑制肽的方案。
【學位授予單位】：浙江海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TP391.7;TQ936.16
【圖文】：

第二章魷魚足多肽制備的工藝優(yōu)化中，與喊性蛋白酶、中性蛋白酶和膜蛋白酶相比，木瓜蛋白酶具有；在鱈魚皮蛋白酶解中，木瓜蛋白酶也具有最高的水解度［７４］。且與Ｆａ魚副產(chǎn)物的酶解實驗中得出一致的結(jié)果。因此木瓜蛋白酶對大多水較高的水解度，且木瓜蛋白酶價格低，酶活高、熱穩(wěn)定性好、天然衛(wèi)以，本實驗選擇木瓜蛋白酶作為水解蛋白酶。逡逑

．．．．ｊ＾逡逑圖２．１不同酶種條件下魷魚足的水解度逡逑Ｆｉｇ．邋２．１邋ＤＨ邋ｏｉ邋ｓｑｕｉｄ邋ｔｅｎｔａｃｌｅ邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｅｎｚｙｍｅ邋ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｓ逡逑加量對水解度的影響逡逑．２可看出，使用木瓜蛋白酶在相同料液比、酶解溫度和時間下，，水解度逐漸提高，當添加量達到１．３％邋（ｗ／ｗ）時，木瓜蛋白酶能力達到最高，隨后開始下降�？赡苁钱斕砻噶坷^續(xù)增大時，出多肽分解為氨基酸而使水解度降低。所以添酶量在１．３％邋（ｗ／ｗ）３０ｎ逡逑

逑２．３．２．３酶解時間對水解度的影響逡逑由圖２．３可看出，使用木瓜蛋白酶在相同料液比、酶添加量和酶解溫度下，隨著逡逑酶解時間的增加水解度逐漸增大，在６ｈ之后，水解度基本沒有變化，推測可能此時逡逑酶與底物反應基本完全，達到飽和狀態(tài)，如果繼續(xù)酶解可能會出現(xiàn)過度酶解現(xiàn)象。逡逑３０１逡逑＋北太平洋魷魚足逡逑＋阿根廷魷魚足逡逑２５－逡逑Ｉ２０＇逡逑＾１５－邐＾逡逑４邐５邐６邐７邐８邐９邐１０逡逑時間（ｈ）逡逑圖２．３不同時間下魷魚足的水解度逡逑Ｆｉｇ．邋２．３邋ＤＨ邋ｏｆ邋ｓｑｕｉｄ邋ｔｅｎｔａｃｌｅ邋ｕｎｄｅｒ邋ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ邋ｔｉｍｅ逡逑２．３．２．４液料比對水解度的影響逡逑由圖２．４可看出，使用木瓜蛋白酶在相同酶添加量、酶解溫度和時間下，隨著水逡逑量的增加水解度逐漸增高，在達到３：１邋（ｖ／ｖ）后，水解度開始隨著水量的增加開始呈逡逑現(xiàn)平緩下降趨勢。推測這可能是因為隨著水量的增加，分子運動活度開始提高，酶與逡逑底物反應加快，當水量持續(xù)增高時，體系濃度逐漸被稀釋，過多的水量也抑制了酶與逡逑底物的反應活度從而抑制了水解反應使水解度降低。因此選擇３：１邋（ｖ／ｖ）的液料比較逡逑合適。逡逑２５１邐？＊■北太平洋魷負足逡逑＋阿根廷魷＆足逡

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