【摘要】：自然環(huán)境中不同物種之間的相互作用十分普遍。利用微生物之間的相互作用可達到提高廢水處理、污染物降解效率的目的。一些微藻和酵母的人工組合在同一培養(yǎng)體系中可表現(xiàn)出動態(tài)的互利關系。目前,微藻-酵母共培養(yǎng)的研究主要集中在工藝優(yōu)化方面,兩物種之間相互作用機制尚不明確。本研究以小球藻和產(chǎn)油酵母為研究對象,篩選出具有協(xié)同作用的最佳組合,再利用代謝組學和轉錄組學等分析手段闡明共培養(yǎng)體系中兩種微生物的相互作用機制。隨后以木薯渣水解液為底物對其強化單細胞油脂生產(chǎn)進行了系統(tǒng)研究。主要研究內(nèi)容如下:(1)采用共培養(yǎng)體系對幾種小球藻及產(chǎn)油酵母的不同組合進行了綜合評價,并驗證了最優(yōu)組合之間協(xié)同效應關系。結果表明,以起始接種密度比為3:1共培養(yǎng)的蛋白核小球藻(Chlorella pyrenoidosa)和粘紅酵母(Rhodotorula glutinis)組合,相對于其他組合而言共生關系更加穩(wěn)定,且生物量及油脂產(chǎn)率顯著提高(p0.05)。與單培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)體系葡萄糖的消耗率及不飽和脂肪酸占總脂肪酸的比例顯著提高。在溶解氧及pH調節(jié)方面,上述微藻和酵母均表現(xiàn)出協(xié)同作用。(2)對篩選出的蛋白核小球藻-粘紅酵母組合進行非接觸式共培養(yǎng),評價了兩種微生物之間的相互作用對各自細胞生長及油脂積累帶來的影響;基于GC/TOF-MS非靶向代謝組學研究了共培養(yǎng)體系中兩物種胞內(nèi)小分子代謝物譜的整體變化。結果表明,共培養(yǎng)體系中粘紅酵母(R.glutinis)的細胞數(shù)量、中性脂熒光值顯著高于單培養(yǎng),且觀察到更多的脂滴。與單培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)中粘紅酵母細胞內(nèi)長鏈脂肪酸酸合成途徑顯著上調,與應激反應、防御抵抗以及調節(jié)滲透相關的肌醇、海藻糖、阿拉伯醇等代謝物豐度也顯著上調。另一方面,共培養(yǎng)中蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)葉綠素熒光更高,與之相對應的中間產(chǎn)物葉綠醇的豐度也顯著上調。谷胱甘肽代謝相關的代謝物顯著上調,以應對環(huán)境壓力。(3)采用基于GC/TOF-MS的非靶向代謝組學分析研究了蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和粘紅酵母(R.glutinis)在非接觸共培養(yǎng)中胞外代謝物譜變化規(guī)律。通過建立Biplot、SUS-plot統(tǒng)計模型結合單變量分析篩選出了具有重要意義的差異性代謝物(biomarkers),并對其生物學意義進行了分析和驗證。結果表明甘油、丙酮酸、琥珀酸及水楊苷等四種代謝物只存在于共培養(yǎng)胞外環(huán)境中,而未在粘紅酵母或蛋白核小球藻的單培養(yǎng)中檢測到。十種分泌物存在于單培養(yǎng)環(huán)境中且共培養(yǎng)中該物質的豐度顯著上調。包括色氨酸、異亮氨酸、丙氨酸、泛酸、草酸、吲哚乙酸等。通過吲哚乙酸反加實驗驗證了其對粘紅酵母(R.glutinis)的促生長作用。(4)基于轉錄組測序技術分別對蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和粘紅酵母(R.glutinis)共培養(yǎng)前期的基因轉錄水平進行了全局性監(jiān)測。蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)響應共培養(yǎng)環(huán)境,可引起色氨酸及吲哚乙酸合成、卟啉和葉綠素代謝、泛醌和其他萜烯類醌的生物合成等生物學過程中相關酶的調控基因顯著上調。粘紅酵母(R.glutinis)響應共培養(yǎng)體系,可上調細胞內(nèi)參與糖酵解、丙酮酸代謝及三羧酸循環(huán)等相關酶的基因表達水平,為脂肪酸的積累提供更多的碳骨架及能量。脂肪酸合成和延伸途徑中關鍵酶的相關基因差異性表達。硬脂酸甘油酯去飽和酶(stearoyl-CoA desaturase)的相關基因表達水平劇烈上調(FC20),說明共培養(yǎng)條件下粘紅酵母(R.glutinis)可通過合成更多不飽和脂肪酸來響應與蛋白核小球藻之間的相互作用。(5)研究了蛋白核小球藻(C.pyrenoidosa)和粘紅酵母(R.glutinis)共培養(yǎng)體系對非脫毒木薯渣水解物底物的微生物油脂生物轉化能力。與單培養(yǎng)相比,共培養(yǎng)體系可得到更高的生物量(20.37±0.38 g L~(-1))和油脂產(chǎn)量(10.42±1.21 g L~(-1))。進一步采用補料分批培養(yǎng),共培養(yǎng)體系的生物量和油脂產(chǎn)量分別提高到31.45±4.93 g L~(-1)和18.47±3.25 g L~(-1)。兩種微生物對木薯渣水解液中的一些副產(chǎn)物均表現(xiàn)出高耐受性,且共培養(yǎng)體系可增強對有毒副產(chǎn)物的降解。
【學位授予單位】：華南理工大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：Q938;TQ641
【圖文】：

中微藻-酵母的協(xié)同作用。DOM：有機溶解物；S產(chǎn)物。gistic effects of microalga and yeast in co-culture. DOorganic matter; SM: secondary metabolite.母共培養(yǎng)體系的應用藻、酵母共培養(yǎng)的研究主要集中在各種廢棄物或近年來國內(nèi)外微藻-酵母共培養(yǎng)的研究進行了總結的選擇是至關重要的。選擇的微藻和酵母種類應了減少物種之間的競爭，它們的營養(yǎng)需求應該是，小球藻和紅酵母種類的搭配得到了廣泛的研究有機碳源被應用于微藻-酵母的共培養(yǎng)中[20]。廢棄物被研究發(fā)現(xiàn)可作為共培養(yǎng)的碳源。普通小

變可能會影響微藻中碳的分配和油脂的積累。如圖etyl-CoA）是三羧酸循環(huán)（Citricate cycle，TCA）及脂胞提供能量和還原碳，丙酮酸被轉化為乙酰輔酶 a，乙成合成代謝途徑所需的 ATP 和碳骨架。在光照條件下光合作用，此時 TCA 循環(huán)相關基因表現(xiàn)出有限的調控應時期，脂肪酸的氧化最有可能為 TCA 循環(huán)提供乙酰間產(chǎn)物檸檬酸也是脂肪酸合成的前體物質。高活性的 酸的合成提供乙酰輔酶 a。通過脂肪酸與乙酰輔酶 a 的A 內(nèi)池。脂肪酸長鏈的形成需要從甘油酰主鏈上形成酰后再酯化回到甘油酰主鏈。這個過程需要脂肪酶和酰漿�；o酶 a 池為葉綠體中 EPA 的合成提供 C18。游PC 或 DGTS 分子中，然后通過肯尼迪途徑（Kennedy 成中[65, 73]。

種產(chǎn)油菌株包括耶氏酵母屬（Yarrowia）、假絲酵母屬（CandTrichosporon）、紅酵母屬（Rhodotorula）等[74]。一些產(chǎn)油酵高達其干細胞重量 70% 的中性脂質。作為酵母細胞中的重要和甾醇酯在一種關鍵營養(yǎng)物質（通常是氮）缺乏的情況下大量可由親水性底物如糖和甘油，或疏水性化合物作為底物的從 1-3 總結了酵母從底物到脂質的代謝途徑[19]。在從頭合成途是在乙酰輔酶 a 羧化酶（ACCase）存在的情況下，與乙酰輔啟動的，從而導致丙二酰 CoA 的合成。后者由�；d體蛋白合成酶（FAS）復合物的�；d體蛋白中，進而使得脂肪酸的id droplet，LD）在細胞中被用來儲存非極性脂質，后者包括磷脂單分子層內(nèi)嵌入的蛋白質，具有各種功能，如脂類生物。酵母種類和環(huán)境條件對脂滴的大小、中性脂質組成和蛋白。

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本文編號：2748524