【摘要】：海藻糖是一種安全無(wú)毒的非還原性二糖,具有穩(wěn)定和保護(hù)生物體或生物大分子等特殊性質(zhì),可應(yīng)用于食品、化妝品、生物制劑、醫(yī)藥和農(nóng)業(yè)等行業(yè)。海藻糖能夠以淀粉為底物,在麥芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)的催化作用下制得,成本低廉,生產(chǎn)潛力大。然而,在反應(yīng)體系中常常會(huì)殘留麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖等低分子量麥芽寡糖副產(chǎn)物,制約著海藻糖產(chǎn)量的提升。添加糖基轉(zhuǎn)移酶,通過其糖基轉(zhuǎn)移反應(yīng)延長(zhǎng)這些低分子量麥芽寡糖的鏈長(zhǎng),使之能夠被MTSase和MTHase進(jìn)一步催化利用,從而能夠提高海藻糖產(chǎn)率。本研究選取了7種不同來源的糖基轉(zhuǎn)移酶應(yīng)用于海藻糖的制備,從中獲得了應(yīng)用效果最佳的源自Bacillus circulans的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(BcCGT)�？疾炝嗣阜磻�(yīng)結(jié)束后的體系組分,發(fā)現(xiàn)仍剩余較多以麥芽糖為主的低分子量麥芽寡糖。為了繼續(xù)提高底物利用率,進(jìn)一步通過定向進(jìn)化獲得了對(duì)麥芽糖受體親和性增強(qiáng)的突變體M234I,提升了海藻糖產(chǎn)率。在此基礎(chǔ)上,將突變體M234I在枯草芽孢桿菌進(jìn)行重組表達(dá),并在3 L罐水平上實(shí)現(xiàn)了突變體M234I的高效制備。主要研究結(jié)果如下:(1)合成了源自Arabidopsis thaliana、Archaeoglobus fulgidus和Corynebacterium glutamicum的三種4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶(4αGTase)基因并以大腸桿菌為宿主進(jìn)行異源表達(dá)。考察了其與本實(shí)驗(yàn)室前期重組表達(dá)的源自Paenibacillus macerans、Bacillus stearothermophilus和Bacillus circulans的三種環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(CGTase)和源自Thermus aquaticus的4-α-糖基轉(zhuǎn)移酶對(duì)海藻糖制備的影響,并進(jìn)行了各酶添加量的優(yōu)化。結(jié)果表明,以濃度為150 g·L~(-1),DE值16的麥芽糊精為底物時(shí),加入1.8 U·mL~(-1)的源自Bacillus circulans的環(huán)糊精葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶(BcCGT)時(shí)海藻糖產(chǎn)率最高,達(dá)到了74.1%,相比對(duì)照提高了24.0%。分析酶轉(zhuǎn)化液組分發(fā)現(xiàn),當(dāng)在反應(yīng)體系中加入糖基轉(zhuǎn)移酶時(shí),海藻糖含量越高,則葡萄糖含量越多,而麥芽糖和麥芽三糖等低分子量麥芽寡糖越少,同時(shí)發(fā)現(xiàn)麥芽糖在這些低分子麥芽寡糖中占比最高。(2)為進(jìn)一步提高海藻糖產(chǎn)率,以大腸桿菌E.coli BL21(DE3)為表達(dá)宿主,設(shè)計(jì)和構(gòu)建了以提高BcCGT對(duì)麥芽糖受體親和力為目的的高通量篩選體系。經(jīng)過多批篩選后,獲得了一株對(duì)麥芽糖受體親和力提高的突變體M234I,并對(duì)野生型酶和突變體進(jìn)行了分離純化和酶學(xué)定性,發(fā)現(xiàn)突變體M234I以麥芽糖為受體的K_m降低至野生型的54.4%。將突變體M234I用于多酶復(fù)配體系生產(chǎn)海藻糖,海藻糖轉(zhuǎn)化率進(jìn)一步提高至77.2%,分析酶反應(yīng)結(jié)束后的組分,發(fā)現(xiàn)體系內(nèi)的葡萄糖和海藻糖含量增加,麥芽糖、麥芽三糖和麥芽四糖等低分子麥芽寡糖減少。(3)構(gòu)建帶有突變體M234I基因的質(zhì)粒pHY300PLK-bccgtM234I的枯草芽孢桿菌重組菌B.subtilis WS11/pHY300PLK-bccgtM234I,并優(yōu)化了重組菌的搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基,確認(rèn)最佳碳源為葡萄糖,最佳氮源為比例為7:1的隆科特玉米漿與大豆蛋白胨。對(duì)重組菌在3 L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵并優(yōu)化了補(bǔ)料培養(yǎng)基的碳氮比,當(dāng)碳氮比為3:1,最高酶活達(dá)到1423.2 U·mL~(-1)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ920.6;TQ281
【圖文】：

第一章 緒論第一章 緒論質(zhì)和功能葡萄糖基以 α-1,1 糖苷鍵相連接而成的非子式為 C12H22O11。海藻糖的 α-1,1 鍵鍵能，使之具有了較高的穩(wěn)定性。海藻糖的常，升溫至 130℃時(shí)脫去結(jié)晶水形成無(wú)水結(jié)于水，且其水溶液性質(zhì)穩(wěn)定。海藻糖的甜為持久，可改善高砂糖含量食品的甜膩感

第一章 緒論參與了與淀粉的結(jié)合，也有研究認(rèn)為該結(jié)構(gòu)用。Domain D 同樣是由較多 β-折疊堆疊而成不清晰，該結(jié)構(gòu)域的存在可能是為了更好地定淀粉酶碳水化合物結(jié)合區(qū)域(CBM)[44]，與淀粉

5圖 1-3 CGTase 催化四種反應(yīng)示意圖白球表示還原端的葡萄糖殘基，黑球表示葡萄糖殘基ig. 1-3 Schematic of the four reactions catalyzed by CGTaresents the glucose at the reducing end and the black ball reresidue轉(zhuǎn)糖基反應(yīng)中，歧化反應(yīng)占主導(dǎo)地位[46]，該反至另一受體上，使得受體鏈變長(zhǎng)[47]，是一種分子

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本文編號(hào)：2744337