【摘要】：N-乙酰神經(jīng)氨酸(NeuAc)是最常見的分布最廣的一種唾液酸(SA),占據(jù)細(xì)胞膜中糖蛋白、糖脂或寡糖的末端位置,在生物學(xué)、病理學(xué)和免疫學(xué)過程中發(fā)揮重要作用。同時(shí)NeuAc也是母乳寡糖中重要的單糖組成單元,具有促進(jìn)嬰兒大腦發(fā)育和增強(qiáng)免疫力等功效。另外NeuAc的衍生物可以作為抗癌、抗粘連和抗病毒藥物,也能作為醫(yī)藥治療中的納米載體特異性的進(jìn)行疾病治療。NeuAc在食用和藥用方面的增長需求,對NeuAc的制備方法提出了更高的要求。然而,傳統(tǒng)提取、化學(xué)法和發(fā)酵法合成NeuAc的較低產(chǎn)量和生產(chǎn)效率以及環(huán)境污染限制了NeuAc的供應(yīng),同時(shí)目前全細(xì)胞轉(zhuǎn)化法的宿主是大腸桿菌(Escherichia coli),NeuAc合成存在的潛在內(nèi)毒素污染風(fēng)險(xiǎn)不利于NeuAc在食品和醫(yī)藥方面的應(yīng)用。在本課題中,我們開發(fā)了一種利用食品級安全級菌株枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)全細(xì)胞轉(zhuǎn)化生產(chǎn)NeuAc的方法。本論文主要研究內(nèi)容如下:(1)首先克隆來自魚腥藻(Anabaena sp.CH1)編碼N-乙酰葡萄糖胺2-差向異構(gòu)酶(AGE)的基因age和來自大腸桿菌(E.coli K12)編碼NeuAc醛縮酶(NanA)的基因nanA至表達(dá)載體pP43NMK,在枯草芽孢桿菌中構(gòu)建以N-乙酰葡萄糖胺(GlcNAc)和丙酮酸為底物合成NeuAc的異源途徑。之后比較了7種不同強(qiáng)度的組成型啟動(dòng)子調(diào)控AGE和NanA表達(dá),構(gòu)建得到一系列不同表達(dá)強(qiáng)度的重組質(zhì)粒,以強(qiáng)啟動(dòng)子P_(43)調(diào)控AGE和NanA表達(dá)的重組菌B6CG/p43AN進(jìn)行全細(xì)胞轉(zhuǎn)化,以1.2 mol·L~(-1)丙酮酸和0.4mol·L~-11 GlcNAc為底物反應(yīng)48 h得到32.84 g?L~(-1) NeuAc,其中GlcNAc的摩爾轉(zhuǎn)化率為26.55%。(2)為了進(jìn)一步尋找更優(yōu)來源的nanA基因,比較了來自大腸桿菌(E.coli K12)、谷氨酸棒桿菌(Corynebacterium.glutamicum ATCC13869)和葡萄球菌(Staphylococcus.hominis EFS20452.1)來源的nanA對全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成NeuAc的影響。全細(xì)胞轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,當(dāng)采用來源于S.hominis的shnanA時(shí),重組菌B6CG/p43ANsh全細(xì)胞轉(zhuǎn)化的NeuAc產(chǎn)量達(dá)到46.04 g?L~(-1),相對于表達(dá)E.coli K12來源的nanA時(shí)提高了40.2%。(3)為了提高NeuAc醛縮酶(ShNanA)的表達(dá)水平,篩選10種枯草芽孢桿菌高表達(dá)蛋白的編碼基因的N-端編碼序列,并且將N-端編碼序列融合于shnanA的5?-末端調(diào)控shnanA表達(dá)。通過比較不同N-端編碼序列融合于shnanA對重組B.subtilis全細(xì)胞轉(zhuǎn)化合成NeuAc的影響,篩選得到一種有效促進(jìn)shnanA表達(dá)和活性的N-端編碼序列N1-tufA,重組菌B6CG/p43ANshN1-tufA的shnanA表達(dá)由N-端編碼序列N1-tufA調(diào)控,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化NeuAc產(chǎn)量達(dá)到56.82 g?L~(-1)。(4)通過敲除alsS和alsD基因阻斷丙酮酸轉(zhuǎn)化為副產(chǎn)物乙偶姻的代謝途徑,阻斷B.subtilis自身對底物丙酮酸的消耗問題,得到的重組菌B6CGSD/p43ANshN1-tufA,全細(xì)胞轉(zhuǎn)化NeuAc達(dá)到68.75 g?L~(-1),其中GlcNAc的摩爾轉(zhuǎn)化率為55.57%。最后對重組菌B6CGSD/p43ANshN1-tufA進(jìn)行菌體培養(yǎng)時(shí)間和全細(xì)胞轉(zhuǎn)化條件的優(yōu)化,包括pH、溫度、表面活性劑種類和濃度、菌體濃度和底物濃度。最終NeuAc產(chǎn)量提高了36.41%,達(dá)到93.78 g?L~(-1),GlcNAc的轉(zhuǎn)化率為50.54%。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：Q78;TQ929
【圖文】：

圖 1-1 NeuAc 化學(xué)結(jié)構(gòu)式Fig. 1-1 The chemical structure of NeuAc-NHCOCH3N-乙酰神經(jīng)氨酸（NeuAc）-NHCOCH2OH N-羥乙酰神經(jīng)氨酸（NeuGA-H 3-脫氧-D-甘油-D-半乳-壬酮

意義與研究內(nèi)容意義圖 1-2 枯草芽孢桿菌產(chǎn) GlcNAc 合成途徑Fig. 1-2 GlcNAc metabolic pathway in B. sublitis

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本文編號：2737826