【摘要】：黑色素在自然界廣泛存在,微生物、動(dòng)物、植物以及人類均可產(chǎn)生黑色素。研究表明,生物體合成的黑色素具有抗氧化、抗紫外輻射、結(jié)合重金屬離子等許多重要的生理功能,可提高生物的生存能力及環(huán)境適應(yīng)性。蘇云金芽胞桿菌(Bt)是一種伴隨著芽胞的產(chǎn)生形成晶體蛋白的革蘭氏陽性細(xì)菌,世界上使用最廣范的生物殺蟲劑。然而,Bt形成的具有殺蟲活性的伴胞晶體作為Bt制劑的主要活性成分在施用的過程中易受到環(huán)境如紫外線的影響而降低殺蟲效果。研究者通過多種方法來提高Bt制劑的抗紫外能力,其中之一便是利用黑色素作為Bt的紫外防護(hù)劑來增加Bt殺蟲劑的持效性。前人研究表明蘇云金芽胞桿菌絕大部分菌株通過高溫誘導(dǎo)可獲得產(chǎn)黑色素表型。本室前期通過高溫誘導(dǎo)傳代培養(yǎng),得到BMB171的高產(chǎn)黑色素突變株BMB181,試驗(yàn)證實(shí)其無需誘導(dǎo)便可在LB培養(yǎng)基、ICPM培養(yǎng)基和發(fā)酵培養(yǎng)基中產(chǎn)生黑色素,并保持了BMB171良好的轉(zhuǎn)化特性和表達(dá)性能,而且生物檢測(cè)結(jié)果也表明BMB181所產(chǎn)的黑色素具有保護(hù)晶體蛋白活性免受紫外線破壞的功能。然而,目前關(guān)于蘇云金芽胞桿菌的產(chǎn)黑色素的確切機(jī)制不甚明了。解析蘇云金芽胞桿菌黑色素的產(chǎn)生機(jī)制不僅能夠增加我們對(duì)Bt的認(rèn)知,更為構(gòu)建具抗紫外線能力的Bt工程菌提供理論基礎(chǔ),對(duì)Bt制劑在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)過程中的應(yīng)用都有很廣泛的意義。自然界中的黑色素主要分類為真黑素和褐黑素和異黑色素,其中DHN黑色素,HPQ黑色素和膿黑色素屬于異黑色素。目前,已報(bào)道了真黑素、DHN黑色素、HPQ黑色素和膿黑色素的生物合成途徑。參與這些黑色素合成途徑相關(guān)的基因是已知的。前期研究發(fā)現(xiàn),編碼酪氨酸酶的基因存在于BMB171基因組序列中,但突變菌株BMB181(BMB171的衍生物)在敲除編碼酪氨酸酶的基因后仍產(chǎn)生黑色素。據(jù)此,我們推測(cè)Bt中存在與酪氨酸酶催化的黑色素合成途徑不同的其他黑色素生成途徑。本研究以高產(chǎn)黑色素菌株BMB181為主要研究對(duì)象,對(duì)蘇云金芽胞桿菌生產(chǎn)黑色素合成機(jī)制開展了研究,主要工作及結(jié)果如下:1.蘇云金芽胞桿菌可通過尿黑酸雙加氧酶突變產(chǎn)生黑色素對(duì)蘇云金芽胞桿菌BMB171基因組序列進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)其中存在這種由尿黑酸介導(dǎo)的酪氨酸代謝通路。在人體中這種由尿黑酸介導(dǎo)的酪氨酸代謝途徑需要六種酶的共同作用。其中尿黑酸雙加氧酶是催化尿黑酸開環(huán)反應(yīng)的關(guān)鍵酶。當(dāng)尿黑酸雙加氧酶失活時(shí),會(huì)導(dǎo)致尿黑酸的積累并氧化聚合形成膿黑色素,最終致使人患尿黑酸癥。我們據(jù)此推測(cè)蘇云金芽胞桿菌也可產(chǎn)生以尿黑酸為前體物的膿黑色素。利用溫敏型質(zhì)粒構(gòu)建hmgA基因插入突變體BMB171ΔhmgA,發(fā)現(xiàn)突變株BMB171ΔhmgA與BMB181具有相同的產(chǎn)黑色素表型。高效液相結(jié)果表明,突變株BMB171ΔhmgA與BMB181在生長(zhǎng)過程中均會(huì)產(chǎn)生尿黑酸的積累。DNA測(cè)序結(jié)果表明BMB181中的hmgA基因存在一個(gè)核苷酸的改變(815C→T)導(dǎo)致BMB181中尿黑酸雙加氧酶一個(gè)氨基酸發(fā)生了錯(cuò)義突變(272G→E)。回補(bǔ)試驗(yàn)證實(shí)菌株BMB171中尿黑酸雙加氧酶在菌株BMB181中表達(dá)后可以恢復(fù)Bt菌株的不產(chǎn)黑色素表型。對(duì)其他的產(chǎn)黑色素Bt菌株CT137及CT153的尿黑酸雙加氧酶基因進(jìn)行測(cè)序發(fā)現(xiàn)CT137 HmgA中氨基酸發(fā)生錯(cuò)義突變(G241D),而CT153HmgA中由于其基因中一個(gè)核苷酸的插入導(dǎo)致發(fā)生終止突變。對(duì)CT137及CT153進(jìn)行回補(bǔ)試驗(yàn)后,重組菌株不產(chǎn)黑色素。這些說明尿黑酸雙加氧酶單點(diǎn)突變可導(dǎo)致蘇云金芽胞桿菌產(chǎn)生黑色素。2.HmgA中的6個(gè)氨基酸殘基發(fā)生單點(diǎn)突變時(shí)會(huì)導(dǎo)致黑色素的形成二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)發(fā)現(xiàn)HmgA中氨基酸殘基Gly272位于β19-β20 loop中,基于BMB181中的HmgA發(fā)生G272E突變導(dǎo)致黑色素產(chǎn)生的特點(diǎn),隨機(jī)選擇了BMB171HmgA中14個(gè)位于β-βloop上或者位于β折疊末端的氨基酸殘基構(gòu)建丙氨酸掃描突變體(G89A、N116A、G119A、D120A、G128A、F136A、K219A、G241A、P245A、H261A、N300A、G323A、H334A及P336A),通過回補(bǔ)試驗(yàn)研究這些突變體對(duì)黑色素產(chǎn)生的影響,結(jié)果發(fā)現(xiàn)有6種突變體(G128A、F136A、G241A、H261A、H334A及P336A)對(duì)黑色素的形成有影響。這說明這6種突變體會(huì)導(dǎo)致HmgA失活,使Bt產(chǎn)生黑色素。雖然通過多序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)這14個(gè)位點(diǎn)在HmgA中高度保守,但是從結(jié)構(gòu)與功能關(guān)系方面來說,位點(diǎn)G128、F136、G241、H334及P336更為保守。對(duì)NCBI數(shù)據(jù)庫中公布了全基因組序列的40余株蘇云金芽胞桿菌菌株進(jìn)行分析,發(fā)現(xiàn)由尿黑酸介導(dǎo)的酪氨酸代謝通路的編碼相關(guān)蛋白的基因(hmgA,hppD及fahA)在上述所有菌株中普遍存在。同時(shí)分析發(fā)現(xiàn)尿黑酸雙加氧酶基因在70種不同血清型Bt菌株中存在。這說明蘇云金芽胞桿菌具有通過突變尿黑酸雙加氧酶產(chǎn)生以尿黑酸為前體物的黑色素的潛力。通過生物信息學(xué)方法分析了Bt尿黑酸雙加氧酶的特點(diǎn)包括疏水性、保守結(jié)構(gòu)域、進(jìn)化樹分析、氨基酸的多態(tài)性及HmgA的三維結(jié)構(gòu)。我們發(fā)現(xiàn)HmgA為親水性蛋白,屬于Cupin-like超家族蛋白。三維結(jié)構(gòu)顯示HmgA由兩個(gè)三聚體結(jié)合形成六聚體結(jié)構(gòu)。活性中心金屬離子Fe~(2+)與3個(gè)氨基酸殘基His298、Glu305及His334配位結(jié)合。氨基酸多態(tài)分析顯示多態(tài)位點(diǎn)有19個(gè)(S23A、S54A、L56V、S71A、S80N、S83T、I87V、I93M、S105T、D110N、T138M、V169L、L199I、E213D、H227Y、A343G、Q384E、Q384D、Y387H、T388N)。然而,這些位點(diǎn)的不同對(duì)黑色素的產(chǎn)生與否并不產(chǎn)生影響,所有這些菌株均不產(chǎn)生黑色素。這說明Bt中的尿黑酸雙加氧酶功能具有一定的保守性,以至于我們從自然界中分離到的Bt菌株絕大多數(shù)都不產(chǎn)黑色素。3.Bt中存在其他不同于pyomelanin的黑色素產(chǎn)生機(jī)制前期已報(bào)道Bt經(jīng)高溫酪氨酸誘導(dǎo)產(chǎn)生可黑色素,然而這種黑色素的產(chǎn)生機(jī)制不是很清楚,推測(cè)是在高溫條件下通過酪氨酸酶催化酪氨酸產(chǎn)生的黑色素。然而酪氨酸酶基因在Bt菌株中并不多見,這說明Bt中可能存在其他與酪氨酸酶有相似活性的蛋白。分析蘇云金芽胞桿菌BMB171中基因組序列的編碼區(qū)發(fā)現(xiàn)其中存在具有多銅氧化酶結(jié)構(gòu)域的Laccase-like蛋白。對(duì)該蛋白的三維結(jié)構(gòu)及活性位點(diǎn)進(jìn)行了相關(guān)的分析,其結(jié)構(gòu)域中含有金屬離子Zn~(2+)結(jié)合活性位點(diǎn),4個(gè)半胱氨酸殘基Cys181,Cys182,Cys239及Cys242與Zn~(2+)配位結(jié)合�；蚪M分析結(jié)果顯示該基因廣泛存在于蘇云金芽胞桿菌中。將Laccase-like蛋白表達(dá)及純化并進(jìn)行活性檢測(cè),初步確定其具漆酶活性。該蛋白與黑色素的關(guān)系需進(jìn)一步探索。另外通過篩選YBT-1518干擾突變體,我們發(fā)現(xiàn)三株突變體產(chǎn)生黑色素。這三株突變體被干擾的基因分別是YBT1518_07140(烯酰基-(�；d體蛋白)還原酶(Fab)),YBT1518_21755(XRE(Xenobiotic Response Element)家族調(diào)控因子)和YBT1518_23810(位點(diǎn)特異性整合酶)。這些蛋白與黑色素的關(guān)系目前還沒有報(bào)道。本研究以高產(chǎn)黑色素Bt菌株BMB181為研究重點(diǎn),闡明了該種黑色素在Bt中的形成機(jī)理。這不僅豐富了對(duì)Bt黑色素形成機(jī)制多樣性的認(rèn)識(shí),同時(shí)也為采用分子遺傳學(xué)手段構(gòu)建高產(chǎn)黑色素的基因工程菌提供理論基礎(chǔ)。本研究為在HmgA中進(jìn)行點(diǎn)突變構(gòu)建抗紫外線的Bt菌株提供理論依據(jù),也為研究人類導(dǎo)致尿黑酸尿癥的基因提供了一個(gè)有意義的模型。
【學(xué)位授予單位】：華中農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ453
【圖文】：

N2，其化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1-1 a所示，其包含吲哚醌結(jié)構(gòu)[17]。另有Ye等從粒毛盤菌YM-404（Lachnum YM-404）分離提純得到黑色素LEM404-a，結(jié)合紅外、紫外、元素分析、質(zhì)譜、氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用、核磁共振等方法研究分析推測(cè)其化學(xué)分子式為C22H12N2O4S2，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1-1 b所示，其基本骨架由吡咯環(huán)及苯環(huán)結(jié)構(gòu)組成[18]。Song等從粒毛盤菌YM226（Lachnum YM226）分離提純得到細(xì)胞內(nèi)黑色素LM，化學(xué)結(jié)構(gòu)如圖1-1 c所示[19]。Zong等從粒毛盤菌YM205（Lachnum YM205）分離提純得到細(xì)胞內(nèi)黑色素LIM205，其分子量為522 Da，分子式為C28H14N2O7S

[21]。黑色素單體經(jīng)過聚合形成納米粒子并組裝成黑色素顆粒（圖1-2）[22]。這些研究表明黑色素結(jié)構(gòu)具有復(fù)雜性及多樣性。圖 1-1 黑色素單體結(jié)構(gòu)a: LEM346的分子結(jié)構(gòu)式[17]b: LEM404-a的分子結(jié)構(gòu)式[18]c: LM的分子結(jié)構(gòu)式[19]d:LIM205的分子結(jié)構(gòu)式[20]e: 屎殼郎中黑色素的分子結(jié)構(gòu)式[21]Fig. 1-1 Proposed structures of melanin monomera: Structure of LEM346 b: Structure of lem404-a c: Structure of LM d: Structure of LIM205 e:Structure of melanin in dung beetle

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本文編號(hào)：2731769