發(fā)布時間：2020-06-22 21:52

【摘要】：RNA聚合酶II轉(zhuǎn)錄的終止代表轉(zhuǎn)錄循環(huán)的最后一步。真核生物終止子通過影響mRNA的穩(wěn)定性、轉(zhuǎn)錄效率和位置對轉(zhuǎn)錄和翻譯過程起到重要的調(diào)控作用。本論文依據(jù)釀酒酵母終止子關(guān)鍵核心區(qū)的序列和結(jié)構(gòu)特點,按照可調(diào)節(jié)、可控制等原則設(shè)計人工終止子,對釀酒酵母人工終止子進(jìn)行克隆和表征,以番茄紅素生物合成途徑在釀酒酵母中的精細(xì)調(diào)控為驗證對象,研究人工終止子對代謝途徑的調(diào)控規(guī)律和對合成途徑代謝流的調(diào)節(jié)效率。主要結(jié)果如下:(1)將合成的含有不同linker 1序列的人工終止子與含有中等強(qiáng)度的啟動子TYS1p和綠色熒光蛋白基因eGFP的驗證載體連接,篩選得到了266個人工釀酒酵母終止子,建立了人工終止子文庫。以eGFP基因的熒光蛋白表達(dá)強(qiáng)度(FI)作為人工終止子強(qiáng)度的表征指標(biāo),酵母人工終止子的強(qiáng)度范圍為2.3648~3.5270,平均熒光強(qiáng)度值為3.0719。(2)通過對人工終止子測序及對終止子linker 1序列分析發(fā)現(xiàn),人工終止子的強(qiáng)度隨著終止子的linker 1序列GC含量的升高而降低。統(tǒng)計文庫中的88個強(qiáng)人工終止子,90個中等強(qiáng)度人工終止子和88個弱人工終止子發(fā)現(xiàn),在弱人工終止子linker 1序列中的任何位置,堿基G的出現(xiàn)概率總是大于強(qiáng)終止子中相應(yīng)位置堿基G的出現(xiàn)概率。且人工終止子強(qiáng)度隨著linker 1序列中堿T的增加而增加。通過改變酵母人工終止子的莖長(由linker 2序列構(gòu)成)發(fā)現(xiàn),莖長的改變對不同強(qiáng)度的人工終止子有不同程度的影響。弱終止子和中強(qiáng)終止子莖長的改變能導(dǎo)致mRNA表達(dá)水平和蛋白質(zhì)產(chǎn)量的升高,表明終止子的強(qiáng)度可通過改變終止子的莖長來調(diào)節(jié)。(3)以番茄紅素外源合成途徑為驗證對象,采用不同強(qiáng)度的人工終止子設(shè)計平行實驗,構(gòu)建由不同強(qiáng)度人工終止子控制下的基因表達(dá)模塊,驗證人工終止子在途徑工程中的應(yīng)用潛力,發(fā)現(xiàn)使用中等強(qiáng)度終止子T-307的菌株控制番茄紅素合成途徑表達(dá)時,合成的番茄紅素產(chǎn)量達(dá)到了26.72 mg/L,比使用弱終止子T-414的菌株產(chǎn)量提高了34.74%。研究說明,人工終止子的強(qiáng)度具有靈活的調(diào)節(jié)性,在基因表達(dá)和代謝途徑精細(xì)調(diào)控中具有較大的應(yīng)用潛力。
【學(xué)位授予單位】：石河子大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ920.1
【圖文】：

番茄紅素在釀酒酵母體內(nèi)的生物合成途徑Fig1-2BiosynthesispathwayoflycopeneinS.cerevisiae

標(biāo)準(zhǔn)曲線

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本文編號：2726294