【摘要】：1,3-丙二醇(1,3-propanediol,1,3-PD)是一種重要的化工原料,應(yīng)用廣泛,主要作為單體合成聚對苯二甲酸丙二酯(PTT)和聚呋喃二甲酸丙二酯(PTF)。目前1,3-PD的生產(chǎn)方法包括化學(xué)法和生物法,生物法具有利用可再生資源、條件溫和、環(huán)境污染小等優(yōu)點(diǎn),越來越受到人們的重視。生物法生產(chǎn)1,3-PD主要是以微生物純培養(yǎng)技術(shù)為基礎(chǔ),需要嚴(yán)格的無菌條件、使用的原料具有一定的純度,同時在發(fā)酵過程中常伴隨乙酸、乳酸、乙醇、2,3-丁二醇(BD)等副產(chǎn)物的生成,給下游產(chǎn)物的分離純化帶來困難并增加了 1,3-PD的生產(chǎn)成本。為了克服純培養(yǎng)技術(shù)的缺點(diǎn),本論文以微生物菌群為研究對象,考察了微生物菌群轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-PD的發(fā)酵特性、微生物菌群中單菌間的相互作用、微生物菌群的穩(wěn)定性以及微生物菌群的結(jié)構(gòu)組成對菌群功能的影響。主要研究結(jié)果如下:(1)從大連海域篩選了兩個微生物菌群DL38和CJD-3,并通過間歇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)對兩個微生物菌群的發(fā)酵性能進(jìn)行比較。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:微生物菌群DL38生產(chǎn)1,3-PD的濃度和轉(zhuǎn)化率要高于微生物菌群CJD-3,并且產(chǎn)生的副產(chǎn)物較少,兩者的副產(chǎn)物中均不含BD,利于產(chǎn)物1,3-PD的分離純化降低生產(chǎn)成本。在間歇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)中微生物菌群DL38最高可耐受200 g/L甘油,1,3-PD的濃度可達(dá)到81.40g/L,轉(zhuǎn)化率為0.63mol/mol。通過微生物菌群結(jié)構(gòu)分析表明兩個微生物菌群發(fā)酵性能的差異與兩個菌群的結(jié)構(gòu)組成有關(guān),主產(chǎn)1,3-PD的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在微生物菌群DL3 8中所占的比例(95.57%)顯著高于在微生物菌群CJD-3中所占的比例(85.99%)。從微生物菌群DL38中分離純化了三株克雷伯氏桿菌(Klebsiella pneumoniae):單菌W3、Y1和Y5。當(dāng)甘油濃度為40g/L時,單菌W3主產(chǎn)1,3-PD(17.84g/L),是微生物菌群DL38的優(yōu)勢菌株;單菌Y5主產(chǎn)1,3-PD(9.63 g/L)和乙醇(7.60 g/L),而單菌Y1主產(chǎn)乙醇(12.69 g/L)。當(dāng)三種單菌按照比例W3:Y5:Y1=208:82:17進(jìn)行混合發(fā)酵時發(fā)酵性能最佳,并且優(yōu)于其他單菌混合比例和單菌W3單獨(dú)發(fā)酵,表明在自然狀態(tài)下微生物菌群的組成具有一定的優(yōu)越性和合理性,并且單菌之間的協(xié)同作用可以提高混合菌群的底物耐受性和1,3-PD的產(chǎn)量。(2)通過間歇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和微生物菌群結(jié)構(gòu)分析,考察了影響微生物菌群穩(wěn)定性及發(fā)酵性能的關(guān)鍵因素。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:隨著傳代培養(yǎng)次數(shù)的增加,微生物菌群DL38的發(fā)酵性能發(fā)生了改變(該此菌群命名為DL38-BH),如發(fā)酵時間延長,1,3-PD的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率下降,并且副產(chǎn)物中乳酸、乙醇的產(chǎn)量增加。通過16SrRNA高通量測序發(fā)現(xiàn),微生物菌群DL38的結(jié)構(gòu)組成發(fā)生了顯著變化,如微生物菌群中主產(chǎn)1,3-PD的腸桿菌科(Enterobacteriaceae)在菌群中的比例從95.57%降低到71.46%,而不產(chǎn)1,3-PD的腸球菌科(Enterococcaceae)和莫拉氏菌科(Moraxellaceae)的比例大幅度增加,分別從2.10%和1.21%增加到15.31%和12.97%。通過間歇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),微生物菌群DL38-BH中主產(chǎn)1,3-PD的單菌W3-BH發(fā)酵甘油的時間延長,并且1,3-PD的產(chǎn)量下降,副產(chǎn)物中乳酸和乙醇的含量大幅度增加;單菌Y5-BH消耗甘油的速度加快,1,3-PD的產(chǎn)量降低,乳酸和乙醇的產(chǎn)量均增加;單菌Y1-BH消耗甘油的速度也加快,1,3-PD、乳酸、乙酸的產(chǎn)量增加,但乙醇的產(chǎn)量有所下降。由此推斷正是由于微生物菌群結(jié)構(gòu)組成和菌群中單菌發(fā)酵性能的變化,導(dǎo)致了原始微生物菌群DL38發(fā)酵性能的改變。(3)通過間歇發(fā)酵實(shí)驗(yàn)和微生物菌群結(jié)構(gòu)分析,考察了離子液體對微生物菌群轉(zhuǎn)化粗甘油生產(chǎn)1,3-PD的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:離子液體對微生物菌群發(fā)酵性能的影響不僅與離子液體的種類有關(guān),還與離子液體和底物的濃度有關(guān)。當(dāng)粗甘油的濃度為60 g/L、[Emim][TfO]為10 g/L時,微生物菌群DL38-BH生產(chǎn)1,3-PD的濃度和轉(zhuǎn)化率顯著提高,分別由23.14g/L、0.45 mol/mol增加到31.17 g/L、0.60 mol/mol。與對照組相比,添加離子液體[Emim][TfO]后的微生物菌群DL38-BH中主產(chǎn)1,3-PD的克雷伯氏菌屬(Klebsiella)的數(shù)量和比例顯著增加,分別由51346個、79.20%增加到55514個、89.50%,而菌群中不產(chǎn)1,3-PD菌屬的含量顯著下降。菌群DL38-BH中Klebsiella含量的增加提高了與甘油代謝相關(guān)的三種關(guān)鍵酶(GDH、GDHt和PDOR)的活性,從而使產(chǎn)物1,3-PD的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率有所提高。在利用單菌進(jìn)行間歇發(fā)酵中,離子液體影響單菌生產(chǎn)副產(chǎn)物的種類和產(chǎn)量,但是對1,3-PD的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率并沒有顯著的影響。由此得出結(jié)論,離子液體通過調(diào)整微生物菌群的結(jié)構(gòu)組成來影響菌群的發(fā)酵性能。(4)通過添加抗生素和微生物菌群中優(yōu)勢種的方式,考察微生物菌群結(jié)構(gòu)的改變對菌群發(fā)酵性能的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:氨芐青霉素雖然提高了微生物菌群DL38-BH中克雷伯氏菌屬所占的比例(由85.86%增加到94.98%),使甘油消耗速度加快,但是1,3-PD的產(chǎn)量并沒有增加,可能是由于菌群中主產(chǎn)乙醇的單菌Y5-BH和Y1-BH比例增加的緣故。通過增加微生物菌群中單菌W3-BH和Y5-BH的比例對菌群結(jié)構(gòu)進(jìn)行調(diào)整,提高了微生物菌群DL38-BH的發(fā)酵性能,發(fā)酵時間由30 h縮短到26 h,1,3-PD的產(chǎn)量和轉(zhuǎn)化率有所增加,分別由 21.31 g/L、0.25 mol/mol 提高到 37.16 g/L、0.35 mol/mol。綜上所述,微生物菌群發(fā)酵技術(shù)可以代替純培養(yǎng)發(fā)酵技術(shù)來解決廉價(jià)原料難以利用、底物轉(zhuǎn)化率低、副產(chǎn)物多、發(fā)酵和分離成本高等產(chǎn)業(yè)化難題,為微生物菌群用于其他生物基化學(xué)品的生產(chǎn)制備提供參考。
【學(xué)位授予單位】：大連理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ923
【圖文】：

２）微生物菌群ＤＬ３８中單菌的鑒定逡逑對單菌Ｗ３、Ｙ１和Ｙ５分離純化后進(jìn)行１６Ｓ邋ｒＤＮＡ序列測序，并將單菌Ｗ３、Ｙ１和逡逑Ｙ５的１６Ｓ邋ｒＤＮＡ序列結(jié)果在ＮＣＢＩ數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行ＢＬＡＳＴ同源性比對，發(fā)現(xiàn)單菌Ｗ３、逡逑Ｙ１和Ｙ５與數(shù)據(jù)庫中尤；ｗｅ

本文編號：2717857