【摘要】：近年來,隨著上游抗體細胞表達技術的提高和培養(yǎng)規(guī)模的擴大,以及抗體藥物的高純度要求和分離純化工藝的復雜性,蛋白A親和層析作為下游抗體捕獲的平臺技術,因價格昂貴、洗脫苛刻、介質利用率低等不足限制了其在抗體大規(guī)模分離純化的應用。短肽仿生親和層析作為一種新型的抗體分離層析技術,因其低成本、高穩(wěn)定性、低免疫原性、高選擇性和洗脫條件溫和等優(yōu)點,是潛在的蛋白A親和層析的替代技術,具有良好的應用前景。為了進一步提高短肽仿生層析介質的動態(tài)結合載量,引入葡聚糖接枝制備高載量的葡聚糖接枝型短肽親和層析介質以提高介質對目標蛋白的平衡吸附容量和傳質速率是改善介質性能的新途徑。本文主要研究了葡聚糖接枝型四肽仿生層析介質的制備及其抗體吸附性能和分離性能,并對比非接枝四肽仿生層析介質的實驗結果,分析葡聚糖接枝對短肽仿生層析的影響,為短肽仿生層析介質的改進提供新思路。本文的主要研究內(nèi)容和取得的結果如下:首先以Ac-YFRH為功能配基,交聯(lián)葡聚糖瓊脂糖基質Bestarose XL為基質,采用HATU法制備了不同配基密度的葡聚糖接枝型四肽仿生層析介質Ac-YFRH-XL,考察了介質對hIgG、BSA和Fc融合蛋白的靜態(tài)吸附性能。實驗結果表明Ac-YFRH-XL介質對hIgG的吸附是疏水相互作用和靜電相互作用共同主導,在pH 9.0時吸附容量可達133 mg/g介質,在pH 5.0無吸附,同時對氯化鈉和辛酸鈉表現(xiàn)出較好的耐鹽性。Ac-YFRH-XL介質對BS A的吸附主要基于靜電相互作用,在pH 5.0時非特異性吸附最高。相同配基密度的Ac-YFRH-XL介質對Fc融合蛋白比hIgG有更高的吸附容量和結合能力,符合前期基于配基和抗體Fc片段間主要結合位點的計算機模擬結果。引入葡聚糖接枝可以增加介質的配基偶聯(lián)密度從而提高其對抗體的吸附容量和結合能力,較非接枝四肽層析介質有優(yōu)勢。接著考察了葡聚糖接枝型四肽仿生層析介質Ac-YFRH-XL對hIgG和BSA的動態(tài)吸附性能。結果表明介質在pH9.0時對hIgG的動態(tài)結合載量(Q10%)可達36.8mg/mL,約2.5倍于非接枝Ac-YFRH-4FF介質的14.9 mg/mL,同時該條件下介質對BSA無吸附。Ac-YFRH-XL介質在低鹽條件(NaC1≤0.2 M)下對抗體有較好的結合能力,高鹽條件下幾乎無吸附,耐鹽性弱于非接枝層析介質。此外,在高于非接枝介質的最大偶聯(lián)密度的一定配基密度范圍內(nèi),葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介質對抗體的結合載量隨之增加,顯著增加了介質在更大規(guī)模分離中的應用潛力。最后探究了葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介質對實際料液體系的分離性能。在pH9.0條件下從混合蛋白(hIgG:BSA=1:4)體系中分離hIgG得到抗體的純度和收率分別為98.7%和89%;在pH9.0條件下從CHO培養(yǎng)上清液中分離單抗得到單抗純度和收率分別為93.0%和84.7%,相較于非接枝Ac-YFRH-4FF介質具有相似的分離效率,但葡聚糖接枝Ac-YFRH-XL介質能達到更高的處理量,顯示了其在更大規(guī)模體系中的分離潛力。
【圖文】：

（Ｉｍｍｕｎｏｇｌｏｂｕｌｉｎ，，ＩｇＧ）作為主要的血清抗體組成部分，其比例高達７５？８０°／0［１４］。逡逑１．２．１抗體的結構逡逑如圖１．１所示，抗體本身由兩條完全相同的重鏈（Ｈｅａｖｙ邋ｃｈａｉｎ，Ｈ鏈）和兩逡逑條相同的輕鏈（Ｌｉｇｈｔ邋ｃｈａｉｎ，邋Ｌ鏈）通過四對二硫鍵相連且呈現(xiàn)Ｙ字型的基本結逡逑構。ＩｇＧ的分子量約為１５０邋ｋＤａ，其中兩條重鏈約為５０邋ｋＤａ，兩條輕鏈約為２５逡逑ｋＤａ［１５，１６］。ＩｇＧ的可變區(qū)位于重鏈和輕鏈的Ｎ端，該區(qū)域氨基酸序列變化較大，逡逑在重鏈和輕鏈所占的比例分別為２５％和５０％；邋ＩｇＧ的恒定區(qū)則位于氨基酸序列更逡逑穩(wěn)定的Ｃ端，一般分為ＣＨＩ，邋ＣＨ２和ＣＨ３。在ＣＨ１與ＣＨ２之間存在鉸鏈區(qū)，逡逑２逡逑

邋＾邋ｕ逡逑Ｃ端逡逑圖１．１邋ＩｇＧ的結構示意圖逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋１．１邋Ｉｌｌｕｓｔｒａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＩｇＧ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ逡逑１．２．２抗體的應用逡逑抗體因其獨特的生物活性而被廣泛應用于生物技術領域和臨床醫(yī)療領域，其逡逑主要的生物活性特點包括：（１）抗原特異性結合：在機體內(nèi)特異性結合外源毒素逡逑或病毒，介導免疫應答反應，促使抗體抗原復合物被巨噬細胞吞噬；（２）激活補逡逑體？．激活補體的經(jīng)典途徑可以通過ＩｇＧ的構型變化所暴露出的ＣＨ２／ＣＨ３的相關逡逑３逡逑
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：TQ464;O658.1

【參考文獻】

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本文編號：2695471