發(fā)布時間：2020-05-29 15:05

【摘要】：酸性脂肪酶是一類在酸性環(huán)境中穩(wěn)定高效地進行油脂水解反應的脂肪酶,在食品、化工、醫(yī)藥、飼料等工業(yè)具有良好的應用前景。本課題將來源于黑曲霉Aspergillus niger NICM 1207和土曲霉Aspergillus terreus的兩種酸性脂肪酶ANL和ATL在畢赤酵母Pichia pastoris GS115中實現(xiàn)外源表達,發(fā)現(xiàn)ANL存在分泌量低以及ATL存在催化活性低的問題。為實現(xiàn)酸性脂肪酶的高效制備,采用融合表達和定點突變的方式改造脂肪酶。將改造后的重組脂肪酶進行分離純化與酶學性質的研究,并研究了酸性脂肪酶在胃腸消化模擬實驗中的應用。主要結果如下:(1)分別將三種融合標簽纖維素結合域(CBD)、麥芽糖結合域蛋白(MBP)和小泛素相關修飾物(SUMO)和ANL進行融合表達,蛋白的表達量均有所提高。其中,與SUMO融合的菌株GS115/pPIC9K-SANL效果最為顯著,在搖瓶水平的總蛋白濃度和酶活分別是原始菌的4.31和1.60倍,在3L發(fā)酵罐水平的酶活達到960 U·m L~(-1),是原始菌的1.85倍。SUMO融合蛋白(SANL)與ANL同樣具有嗜酸特性,即在pH2.5催化活性最高且穩(wěn)定于pH4.0-10.0。與ANL相比,SANL對橄欖油、三油酸甘油酯和對硝基苯酚棕櫚酸酯(p-NPC_(16))的K_m值分別降低了0.42、0.69和0.15倍,而k_(cat)/K_m值分別提高了1.18、1.79和5.51倍。結果表明融合表達不僅提高了ANL的表達水平而且酶的催化效率也得到了增強。(2)運用理性設計的方法,通過同源比對,選擇脂肪酶蓋子區(qū)域和底物結合口袋域中的位點進行定點突變,得到8種ATL的突變脂肪酶。其中,蓋子區(qū)域突變酶ATLLid與底物結合口袋域突變酶ATLV218W的催化活性顯著提高。ATLLid和ATLV218W對底物對硝基苯酚月桂酸酯(p-NPC_(12))的催化活性最高,k_(cat)值較ATL分別提高了39.37和50.79倍,k_(cat)/K_m值較ATL分別提高了2.85和8.48倍。與ATL相比,ATLLid和ATLV218W的最適pH為5.0,pH4.0-8.0具有較好的穩(wěn)定性,說明突變未對ATL的嗜酸耐酸特性產生影響,但是突變導致熱穩(wěn)定性略有下降。最后,通過生物信息學分析了ATLLid和ATLV218W催化活性提高的機理。(3)開展了酸性脂肪酶在胃腸消化模擬實驗中的應用研究。在胃消化模擬實驗中,ANL和SANL對胃蛋白酶pepsin具有很好的耐受性,且在pH3.0-6.0范圍內油脂水解活性高、穩(wěn)定性強,而ATL、ATLLid和ATLV218W對pepsin的耐受性略差,表明黑曲霉脂肪酶在胃消化中更具優(yōu)勢。在腸消化模擬實驗中,兩類酸性脂肪酶均在4 mmol·L~(-1)NaTDC中受到強烈的抑制作用,導致油脂水解受到限制。將ANL和SANL分別與本研究室的華根霉Rhizopus chinensis CCTCC M201021的脂肪酶RCL復配進行在胃腸消化模擬環(huán)境中的油脂水解反應時,ANL和SANL表現(xiàn)出在胃消化模擬階段的優(yōu)勢,而RCL可協(xié)助酸性脂肪酶在腸消化階段進一步的油脂水解工作。
【圖文】：

圖 1-1 主要研究思路流程圖Fig. 1-1 Flow chart of main research ideas.1.3.2 課題研究內容(1) 通過文獻查閱及搜索 NCBI 數(shù)據庫，獲得 ANL 和 ATL 的基因序列。參照畢赤酵母密碼子偏好性進行優(yōu)化并合成基因，分別構建表達 ANL 和 ATL 的基因工程菌，實現(xiàn)其在畢赤酵母中的異源表達。(2) 通過將蛋白標簽與黑曲霉脂肪酶融合，研究融合表達對脂肪酶在畢赤酵母中表達水平的影響。本課題選擇 MBP、CBD 和 SUMO 三種融合標簽，利用(GGGGS)2作為連接肽，構建與 ANL 的融合的重組表達菌株。通過檢測搖瓶發(fā)酵過程中菌體濃度、胞外蛋白分泌總量和上清液酶活數(shù)據來分析融合表達的影響。(3) 研究融合了 SUMO 標簽的黑曲霉脂肪酶融合蛋白 SANL 在 3L 發(fā)酵罐中的擴大培養(yǎng)。實時監(jiān)測誘導發(fā)酵過程中菌體濃度 OD600、蛋白濃度，酶活等發(fā)酵參數(shù)的變化情況。(4) 通過理性設計的方法，在 ATL 的蓋子區(qū)域和底物結合口袋域中選擇突變位點進

株的菌株生長及蛋白表達的誘導表達在含有 250μg·mL-1G418 的 YPD 平板上劃線，30oC 培落，接種至 25 mL BMGY 培養(yǎng)基中，30oC，200 r·min6。6000r·min-1離心 10min，收集菌體并用 100mL 的r·min-1振蕩培養(yǎng) 120h，每隔 24h 添加 1%的甲醇誘導表清的蛋白濃度和酶活性。定方法檢測利用 Bradford 蛋白濃度試劑盒進行定量[87]。以 5m白標準，，分別用水稀釋至不同濃度 0，0.125，0.25，0.μL 不同濃度的蛋白標準液加至 96 孔板中，并在各孔中染色液，混勻且勿產生氣泡，用酶標儀在 595 nm 波長線見圖 2-1。
【學位授予單位】：江南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925.6

【參考文獻】

相關期刊論文 前5條

1 賀文成;鄭志剛;肖都;;胰腺外分泌功能不全對危重癥患者預后的影響[J];實用醫(yī)學雜志;2015年20期

2 楊滔;桂濤;李春梅;王有芳;;脂肪酶及其在飼料工業(yè)中的應用研究[J];飼料工業(yè);2011年S1期

3 閆麗娟;謝振榮;趙春雷;高潤池;李俊;唐湘華;黃遵錫;;耐高溫酸性脂肪酶菌株NJY-1-3的選育及發(fā)酵條件的研究[J];食品科技;2010年03期

4 王海燕;李富偉;高秀華;;脂肪酶的研究進展及其在飼料中的應用[J];飼料工業(yè);2007年06期

5 李彥春,程寶箴,張銘讓;酸性酶軟化藍濕皮的研究[J];中國皮革;2001年21期

相關博士學位論文 前3條

1 沙沖;華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶在異源宿主中的高效分泌表達[D];江南大學;2015年

2 田健;計算機輔助分子設計提高蛋白質熱穩(wěn)定性的研究[D];中國農業(yè)科學院;2011年

3 舒正玉;黑曲霉脂肪酶的酶學性質、基因克隆與表達及結構預測[D];華中科技大學;2007年

本文編號：2687100