【摘要】：連翹花為木犀科植物連翹Forsythia suspensa(Thunb.)vahl的干燥花。連翹作為山西的道地藥材,傳統(tǒng)以果實入藥,其花通常被棄用,造成很大程度上的資源浪費。本實驗室的前期研究工作顯示,連翹花具有美白功效。因此,為了充分利用連翹花資源和探究連翹花美白物質(zhì)基礎(chǔ),本文首先對連翹花的質(zhì)量控制標準進行了研究,為有效控制化妝品原料的質(zhì)量一致性提供依據(jù);在此基礎(chǔ)上以酪氨酸酶為作用靶點,分別在分子水平和細胞水平對連翹花提取物進行了抑酶作用的研究,探討并尋找抑酶有效部位和活性成分。進一步研究了連翹花提取物抑酶有效部位的制備工藝,并測定了有效部位化學(xué)成分的含量,以期為連翹花作為天然的美白劑應(yīng)用于化妝品行業(yè)提供理論依據(jù)。實驗內(nèi)容如下:1.對7批連翹花進行標準研究,包括檢查項(水分和總灰分)、浸出物量、指標性成分含量測定及特征圖譜的建立等。根據(jù)2015版《中國藥典》的測定方法,水分的檢查按照附錄IXH項下烘干法,擬定水分含量不得超過10%;總灰分的檢查按照附錄IXK項方法,擬定總灰分含量不得超過7%;浸出物按照附錄X項方法,擬定浸出物含量不得少于28%。建立HPLC方法測定連翹花中連翹酯苷A、蘆丁、連翹苷含量,根據(jù)實驗結(jié)果擬定了連翹花指標性成分的含量最低限量,即連翹酯苷A的含量不得低于3.0%,蘆丁的含量不得低于2.7%,連翹苷的含量不得低于0.8%。利用HPLC法建立連翹花的特征圖譜,根據(jù)對7批樣品的測定分析,擬定特征圖譜中的共有峰(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁和連翹苷作為連翹花特征峰。2.采用大孔樹脂D101柱對連翹花水提物進行粗分離,得到H-1、H-2、H-3、H-4、H-5五個組分;首先在分子水平對連翹花粗提物及五個洗脫部位進行抑制蘑菇酪氨酸酶活性的篩選。實驗結(jié)果表明:連翹花的粗提物體現(xiàn)出對酪氨酸酶活性具有抑制作用,且在實驗濃度范圍內(nèi)隨著藥物濃度的增大,抑制率呈上升趨勢。其中,H-3部位表現(xiàn)出較強的抑制作用,其IC_(50)為0.82 mg/mL與陽性對照物熊果苷相近。進一步在細胞水平進行驗證,H-3部位對細胞內(nèi)酪氨酸酶活性亦有較強的抑制作用,同時其產(chǎn)生的黑色素含量最低。因此,有效部位H-3可能是一種潛在的黑色素合成抑制劑。3.利用凝膠柱層析與制備型高效液相色譜對H-3有效部位進行成分分離鑒定,分離得到5個化合物。其中通過HPLC分析及標準品比對確定了3個化合物,分別為(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷A、蘆丁。此外,利用核磁共振~(13)C NMR及標準品比對確定另2個化合物分別為異連翹酯苷和連翹酯苷H。進一步在分子水平和細胞水平上,對分離得到5個成分進行了抑制酪氨酸酶酶活力測試。實驗結(jié)果顯示異連翹酯苷和連翹酯苷A對酪氨酸酶酶活抑制能力最強,同時對細胞內(nèi)的黑色素合成具有較強抑制率。據(jù)此推測異連翹酯苷和連翹酯苷A是抑酶作用的主要成分。4.通過大孔樹脂對H-3有效部位進行中壓制備工藝研究。方法:以有效部位內(nèi)5種指標成分(異連翹酯苷、(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、連翹酯苷H、連翹酯苷A、蘆丁)的HPLC圖譜分析為依據(jù),考察了樣品上樣量和洗脫體積。并對洗脫物進行得率及抑酶實驗的測定。最終確定大孔樹脂中壓制備工藝的最佳條件為:柱材料為95 g,上樣濃度為200 mg/mL,洗脫流速為20 mL/min時,上樣量為14 g,棄去1.6 L水洗脫液和1.6 L 20%乙醇洗脫液,收集2.4 L 40%乙醇洗脫液并減壓濃縮干燥,得到H-3部位。為后續(xù)有效部位的中試工藝規(guī)模生產(chǎn)提供科學(xué)有效的方法。5.采用HPLC色譜法對5批H-3有效部位樣品中已確認的5種成分的含量進行測定。結(jié)果顯示,5批樣品中5種成分的總含量均達到H-3有效部位含量的50%,且RSD=3.97%,說明該制備方法得到的樣品質(zhì)量相對穩(wěn)定可靠。
【圖文】：

第二章 連翹花標準初步研究1-4 號色譜峰為共有峰，，且峰面積相對較大。所以，將這 4 個峰作為連翹花特征圖譜中的特征峰。根據(jù)上述 7 批樣品的測定結(jié)果，選擇各批樣品均具有的主要色譜峰作為對照特征圖譜（如圖 2.2A），將實驗室標準品溶液在相同的色譜條件下進樣分析（如圖 2.2B），并與連翹花特征圖譜中的色譜峰的保留時間進行對比，最終確定圖譜峰中的峰 1 為(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷、峰 2 為連翹酯苷 A、峰 3 為蘆丁、峰 4 為連翹苷。2

圖 2.2 連翹花對照特征圖譜及其特征峰指認Fig 2.2 F.suspensa flower comparison feature map and its characteristic peak identification峰 1 為(+)-松脂素-β-D-吡喃葡萄糖苷((+)-pinoresinol-β-D-glucopyranoside)；峰 2為連翹酯苷 A(forsythiaside A)；峰 3 為蘆丁(rutin)；峰 4 為連翹苷(philliyrin)圖 A 為連翹花樣品圖譜 圖 B 為標準品圖譜 小結(jié)1．對 7 批連翹花進行標準研究，包括檢查項（水分和總灰分）、浸出物量、指成分含量測定及特征圖譜的建立等。根據(jù) 2015 版《中國藥典》的測定方法，水檢查按照附錄 IXH 項下烘干法，擬定水分含量不得超過 10%；總灰分的檢查按錄 IXK 項方法，擬定總灰分含量不得超過 7%；浸出物按照附錄 X 項方法，擬出物含量不得少于 28%。不同產(chǎn)地的藥材檢查項及浸出物含量之間的差異可能材的地域有關(guān)，還可能與預(yù)處理方式和采收期（花蕾期、盛花期、結(jié)果期）等。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ658

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