【摘要】：秸稈由木質(zhì)素包裹纖維素和半纖維素構(gòu)成復(fù)雜的結(jié)構(gòu)。開發(fā)利用秸稈資源關(guān)鍵是如何降解木質(zhì)素。降解木質(zhì)素的方法有多種,其中生物學(xué)方法,特別是酶法具有條件溫和、時(shí)間短、無需占用大量的場地而受到廣泛的關(guān)注。秸稈降解有多種酶的參與,研究秸稈木質(zhì)素降解過程中多種酶的協(xié)同作用機(jī)制,有助于提高秸稈中木質(zhì)素的降解效率。本試驗(yàn)以一株高產(chǎn)木質(zhì)素過氧化物酶(LiP)的青霉菌JSU-003,通過單因素及正交試驗(yàn)優(yōu)化青霉固態(tài)發(fā)酵合成LiP的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件,從發(fā)酵液中酶活性與預(yù)處理后基質(zhì)糖化的糖得率回歸分析角度以及純化的酶和發(fā)酵液粗酶液對(duì)底物的親和力和最大反應(yīng)速率角度研究了纖維素酶在LiP催化過氧化氫氧化降解秸稈木質(zhì)素過程中的協(xié)同作用,為秸稈生物降解、以及篩選及誘變高產(chǎn)LiP菌株奠定理論基礎(chǔ)。研究得到的主要結(jié)論如下:(1)分離獲得的菌株JSU-003通過形態(tài)學(xué)及ITS鑒定為青霉。單因素試驗(yàn)顯示青霉固態(tài)發(fā)酵合成LiP最佳碳源為麥芽糖、甘油,最佳氮源為玉米蛋白粉、硝酸鉀、魚粉蛋白胨,正交試驗(yàn)結(jié)果顯示菌株JSU-003合成LiP最適培養(yǎng)基為麥芽糖1%,甘油1.5%,魚粉蛋白胨1.5%,硝酸鉀0.5%,玉米蛋白粉1.5%,最佳發(fā)酵條件為料濃度50%,培養(yǎng)溫度27℃,原料用6%的氫氧化鈉預(yù)泡28 h,后經(jīng)過113℃滅菌24 min。在此條件下,發(fā)酵第四天LiP酶活達(dá)到最大值18.04U/g。(2)以纖維素酶三個(gè)組分羧甲基纖維素鈉酶、濾紙纖維素酶和β-葡萄糖苷酶的單獨(dú)作用和交互作用用主成分分析法(PCA)構(gòu)建三種酶的綜合水解指數(shù)(CHI),以糖得率(Y_(trs))作為響應(yīng)值,LiP、CHI為自變量,用SPSS軟件進(jìn)行回歸分析,研究結(jié)果顯示發(fā)酵物中纖維素酶糖化能力與糖得率呈負(fù)相關(guān),即秸稈木質(zhì)素氧化降解過程中,纖維素的糖化抑制木質(zhì)素的氧化降解。(3)用DEAE-Sepharose Fast Flow陰離子交換柱層析,SephadexS-100凝膠過濾層析等方法分離純化LiP。經(jīng)過DEAE-FF離子交換層析后LiP達(dá)到了17.9的純化倍數(shù),64%的酶活回收率和3.6%的蛋白回收率;經(jīng)過Sephacryl S-100 HR凝膠層析后LiP達(dá)到了21.5的純化倍數(shù),17%的酶活回收率和0.7%的蛋白回收率。SDS-PAGE電泳結(jié)果顯示一條帶,對(duì)LiP進(jìn)行蛋白質(zhì)譜鑒定及X射線衍射分析,得到蛋白分子量為45.4 kDa,得到的肽序列為lsahsvaavndvdptvqglp。比較發(fā)酵液中LiP和純化的LiP米氏常數(shù)和最大反應(yīng)速率,純酶對(duì)秸稈木質(zhì)素底物具有較大的親合力和最大反應(yīng)速率,進(jìn)一步證明了纖維素的糖化產(chǎn)物葡萄糖抑制木質(zhì)素的氧化降解。(4)比較經(jīng)純化的LiP以及發(fā)酵液中LiP降解木質(zhì)素動(dòng)力學(xué)參數(shù),純化的酶μ_(max)(1.15 mg/mL/h)高于發(fā)酵液中LiP的μ_(max)(0.86 mg/mL/h),K_m(3.02 mg/mL)小于發(fā)酵液中LiP的K_m(4.74 mg/mL),結(jié)果證明與發(fā)酵液中LiP相比,LiP純化增加了酶與底物的親和力,提高了最大反應(yīng)速率。這個(gè)結(jié)論也進(jìn)一步證明發(fā)酵液中纖維素酶對(duì)LiP催化H_2O_2氧化降解木質(zhì)素的干擾作用。
【圖文】：

式：1000100m4mL1minmL10Lmol10μmol631 ，試驗(yàn)結(jié)果以三次的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表析基上培養(yǎng)時(shí)，菌落顏色由白色轉(zhuǎn)變成灰如圖 2.1 所示，，其形態(tài)特征為：菌絲有膨大的頂囊，產(chǎn)生不對(duì)稱的帚狀體，單子鏈。初步鑒定該菌屬于青霉屬。

圖 2.2 ITS 全序列的瓊脂糖凝膠電泳圖Fig 2.2 agarose gel electrophoresis of ITS sequenceM：DNA mark； 1： ITS 序列擴(kuò)增結(jié)果性比較分析 DNA 序列分析，通過與 GenBank 數(shù)據(jù)庫青于青霉的一種（Penicillium sp.）。獨(dú)特的生物技術(shù)優(yōu)勢(shì)，例如較高的發(fā)酵生產(chǎn)代謝產(chǎn)物抑制，對(duì)無菌性的要求較低，本試，探究 LiP 最佳工藝條件。香族環(huán)化合物使之?dāng)嗔褟亩到饽举|(zhì)素化合
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：TQ925

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2664906