【摘要】：隨著生物醫(yī)藥技術(shù)的發(fā)展,抗體藥物在醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用越來(lái)越廣泛。抗體藥物的下游分離工藝作為抗體藥物生產(chǎn)的重要環(huán)節(jié)在近年內(nèi)發(fā)展較為緩慢。目前應(yīng)用較廣的蛋白A親和層析介質(zhì)在具有高親和力和選擇性的同時(shí)也存在抗體洗脫條件苛刻和配基易脫落等局限。本論文通過(guò)計(jì)算機(jī)模擬的方法研究蛋白A和抗體間的相互結(jié)合過(guò)程,分析蛋白A中關(guān)鍵氨基酸殘基,設(shè)計(jì)構(gòu)建高選擇性的仿生短肽配基并結(jié)合疏水電荷誘導(dǎo)配基,研究開(kāi)發(fā)具有高選擇性及溫和洗脫條件等特點(diǎn)的組合型抗體分離配基,為新型配基的設(shè)計(jì)和抗體分離提供新的思路和方法。首先通過(guò)分子動(dòng)力學(xué)模擬研究了蛋白A和抗體Fc片段之間的結(jié)合模式,進(jìn)一步通過(guò)自由能分解法,篩選出蛋白A配基上的熱點(diǎn)殘基,以及各個(gè)殘基與Fc片段的相互作用能。在此基礎(chǔ)上設(shè)計(jì)組合型配基FYQ-ABI(苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酰胺-5氨基苯并咪唑)。通過(guò)分子模擬的方法研究配基-蛋白間的相互作用以及結(jié)合模式。分子動(dòng)力學(xué)模擬表明,配基在中性條件下能穩(wěn)定地結(jié)合在Fc片段上,疏水相互作用和靜電相互作用在結(jié)合過(guò)程中起到了重要的作用。以瓊脂糖為基質(zhì)制備了FYQ-ABI層析介質(zhì),考察介質(zhì)的靜態(tài)以及動(dòng)態(tài)吸附分離性能。結(jié)果表明FYQ-ABI介質(zhì)對(duì)hIgG表現(xiàn)出較強(qiáng)選擇性,從hIgG/BSA混合蛋白溶液中分離hIgG,可以得到純度超過(guò)99%的hIgG。優(yōu)化配基偶聯(lián)方法,制備高配基密度的FYQ-ABI介質(zhì)。介質(zhì)對(duì)hIgG的吸附能力隨著配基密度的升高而越高。在pH 7.0的條件下,介質(zhì)的動(dòng)態(tài)載量可達(dá)到20.1 mg/mL介質(zhì)。FYQ-ABI對(duì)hIgG有較高吸附量和較好的耐鹽性,并且可以通過(guò)添加NaCl的方法來(lái)提高介質(zhì)的選擇性。用0.1 M NaOH測(cè)定配基穩(wěn)定性時(shí)發(fā)現(xiàn)隨著處理的時(shí)間延長(zhǎng),FYQ-ABI介質(zhì)對(duì)hIgG的吸附量變化較小,但是HSA的吸附量急劇下降,進(jìn)一步驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)FYQ-ABI配基上谷氨酰胺的酰胺基團(tuán)在一定條件下會(huì)發(fā)生水解而提高配基的選擇性。合成水解后的配基FYE-ABI(苯丙氨酸-酪氨酸-谷氨酸-5氨基苯并咪唑),并偶聯(lián)到瓊脂糖基質(zhì)上進(jìn)行相關(guān)測(cè)試。在pH 7.0的條件下該配基具有最大飽和吸附容量91.5 mg/g介質(zhì)。保留時(shí)間為2min的條件下,介質(zhì)的hIgG動(dòng)態(tài)載量可以達(dá)到22.3 mg/mL介質(zhì)。考察不同洗脫pH對(duì)保留因子和洗脫收率的影響,結(jié)果表明抗體在pH 4.0～pH 5.0的條件下就能被有效地洗脫下來(lái),可以作為后續(xù)分離的洗脫條件。進(jìn)一步考察介質(zhì)從HSA/hIgG混合蛋白和人血清中分離hIgG的能力,其中分離人血清的最優(yōu)洗脫pH為4.5,此時(shí)hIgG的純度和收率分別為93.9%和88.9%。
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圖１．１抗體分子結(jié)構(gòu)示意圖逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ邋ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ邋ｏｆ邋ａｎｔｉｂｏｄｙ逡逑９７５年Ｋｏｈｌｅｒ和Ｍｉｌｓｔｅｉｎ發(fā)明了雜交瘤細(xì)胞技術(shù)制備單克隆抗體，第一次成逡逑體外合成了單克隆抗體，并于１９８４年獲得諾貝爾獎(jiǎng)［１氣自從單抗出現(xiàn)以來(lái)，逡逑用范圍在不斷拓寬，包括（１）免疫診斷、腫瘤的診斷、多肽激素的檢測(cè)以逡逑的病毒細(xì)菌檢測(cè)診斷等；（２）細(xì)胞表面結(jié)構(gòu)的區(qū)別和精細(xì)分析；（３）疾病逡逑域應(yīng)用［１１１。自１９８６年首個(gè)獲批上市的抗體藥物Ｏｒｔｈｏｃｌｏｎｅ邋０ＫＴ３問(wèn)世以來(lái)，逡逑２０１７年底全球批準(zhǔn)上市的單抗藥物總計(jì)達(dá)７３個(gè)。單抗藥物在自身免疫性疾逡逑菌感染類疾病、癌癥等［１２］疾病的治療中發(fā)揮著重要的作用。近年來(lái)抗體藥逡逑展十分迅速，抗體新藥獲批呈現(xiàn)井噴趨勢(shì)。表Ｕ列舉了邋２０１７年全球銷售逡逑５的抗體藥物。面對(duì)如此龐大的市場(chǎng)需求，對(duì)于抗體藥物生產(chǎn)將是一個(gè)巨大逡逑

本文研究的是蛋白Ａ和Ｆｃ片段的相互作用。首先從ＰＤＢ蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)選取分逡逑辨率為２．９Ａ的Ｆｃ片段模型（編號(hào)：１ＦＣ１），它由兩條相同的鏈（Ａ鏈和Ｂ鏈）構(gòu)逡逑成如圖２．２所示。為減少計(jì)算量，對(duì)Ａ鏈進(jìn)行分子對(duì)接和分子動(dòng)力學(xué)模擬。刪除逡逑其中的糖基、游離離子和水分子，并從Ｈ＋＋網(wǎng)絡(luò)計(jì)算服務(wù)平臺(tái)獲得不同ｐＨ下氨基逡逑酸殘基的質(zhì)子化狀態(tài)，其中鹽濃度設(shè)置為２０ｍＭ，邋ｐＨ設(shè)定為相應(yīng)值，其它為默認(rèn)逡逑參數(shù)。采用邋Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ邋Ｓｔｕｄｉｉｏ邋３．０邋軟件包（ＤＳ邋３．０，，邋Ａｃｃｅｌｒｙｓ邋Ｉｎｃ．，Ｓａｎ邋Ｄｉｅｇｏ，邋ＵＳＡ）逡逑構(gòu)建仿生配基結(jié)構(gòu)，基質(zhì)部分用f窕硎荊⒉捎茫櫻恚幔潁簦停椋睿椋恚椋澹蚰？榻心芰垮義嫌嘔ｅ義希＃穡

本文編號(hào)：2663608