發(fā)布時(shí)間：2020-05-14 07:37

【摘要】：腫瘤細(xì)胞周期相關(guān)及表達(dá)上調(diào)蛋白(Cell-cycle-Related and Expression Elevated Protein in Tumor,CREPT,Gene ID:58490)一種新發(fā)現(xiàn)的在腫瘤發(fā)生過(guò)程中增強(qiáng)細(xì)胞增殖的人類腫瘤相關(guān)蛋白,在大多數(shù)腫瘤中被證實(shí)存在過(guò)表達(dá)。而CREPT基因本身表達(dá)水平在腫瘤組織中升高的分子機(jī)制尚不清楚。人抗原R(Human antigen R,HuR)是一種RNA結(jié)合蛋白,其與某些基因mRNA的3′非編碼區(qū)(3′UTR)中的富含AU的元件(AU-rich element,ARE)結(jié)合,可穩(wěn)定mRNA并調(diào)節(jié)其翻譯。CREPT mRNA具有較長(zhǎng)的3′UTR區(qū),為多種RNA結(jié)合蛋白及miRNAs的結(jié)合提供了廣泛的結(jié)合位點(diǎn)。本研究在明確HuR對(duì)CREPT表達(dá)存在調(diào)控的基礎(chǔ)上,進(jìn)一步分析了miR-383與HuR對(duì)CREPT表達(dá)的共調(diào)控作用,為結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制奠定理論基礎(chǔ)。在本研究中,利用Western Blot實(shí)驗(yàn),研究HuR對(duì)CREPT蛋白水平表達(dá)調(diào)控,發(fā)現(xiàn)HuR可正向調(diào)控CREPT表達(dá)。觀察到HuR敲降可使CREPT的表達(dá)在結(jié)腸癌細(xì)胞中下調(diào);Western Blot、RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)HuR過(guò)表達(dá)上調(diào)了CREPT在mRNA和蛋白水平的表達(dá)。通過(guò)RNA-IP實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)HuR和CREPT mRNA存在直接相互作用,進(jìn)一步使用熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè),發(fā)現(xiàn)HuR直接靶向CREPT mRNA的3′-UTR特定位點(diǎn)。在此基礎(chǔ)上,進(jìn)一步明確HuR和miR-383共同調(diào)節(jié)CREPT的表達(dá)。此外,通過(guò)CCK-8法、細(xì)胞劃痕、克隆形成實(shí)驗(yàn),系統(tǒng)研究了HuR對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞HCT116β/ω增殖、細(xì)胞遷移、克隆形成能力的影響。通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè),對(duì)HuR對(duì)細(xì)胞周期和凋亡的影響進(jìn)行探究。結(jié)果表明,HuR促進(jìn)了結(jié)腸癌細(xì)胞的細(xì)胞增殖和集落形成,并且促使細(xì)胞周期快速進(jìn)入G_2/M期,同時(shí)抑制了細(xì)胞凋亡。本研究證明了HuR在結(jié)腸癌細(xì)胞中的穩(wěn)定過(guò)表達(dá)促進(jìn)了結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)。研究結(jié)果顯示,CREPT在結(jié)直腸癌中的高表達(dá)歸因于HuR水平過(guò)表達(dá)。系統(tǒng)探索了RNA結(jié)合蛋白HuR對(duì)CREPT mRNA的調(diào)控機(jī)制,揭示其在結(jié)直腸癌的發(fā)生、發(fā)展過(guò)程中發(fā)揮著重要作用。綜合探索了HuR與miR-383對(duì)CREPT蛋白的研究,揭示了結(jié)直腸癌發(fā)生的分子機(jī)制并為新型靶向性藥物發(fā)現(xiàn)奠定基礎(chǔ)。
【圖文】：

再利用 Western Blot、RT-PCR、Luciferase Assay 及定點(diǎn)突變技術(shù)對(duì) HuR、CREPT進(jìn)行蛋白水平及 mRNA 水平檢測(cè)，確定 HuR 對(duì) CREPT 蛋白表達(dá)的調(diào)控作用并確定其可能調(diào)控位點(diǎn)。通過(guò) CCK-8 法、克隆形成等實(shí)驗(yàn)，系統(tǒng)探索了 HuR 蛋白對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、克隆形成能力的影響。通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)，研究了 HuR 對(duì)細(xì)胞周期的影響。本論文第 2 章通過(guò) Western Blot 實(shí)驗(yàn)和 RT-PCR 實(shí)驗(yàn)，首先明確 CREPT 表達(dá)量中等的結(jié)直腸癌細(xì)胞株，有利于后續(xù)對(duì)其表達(dá)機(jī)制的研究。利用轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)，，在篩選出的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中轉(zhuǎn)染系列 HuR siRNAs 的基礎(chǔ)上，通過(guò) Western Blot、RT-PCR確定可以高效敲降 HuR 的 siRNA。利用 ARE site 位點(diǎn)預(yù)測(cè)、LuciferaseAssay 和定點(diǎn)突變確定HuR 蛋白與CREPT mRNA可能的結(jié)合位點(diǎn)。第3章通過(guò)轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)探究 HuR對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞株增殖、克隆形成、轉(zhuǎn)移和細(xì)胞周期的影響。在前面研究基礎(chǔ)上，第 4 章系統(tǒng)探索了 HuR 和 miR-383 共同對(duì) CREPT 蛋白水平、mRNA 水平的影響，并進(jìn)行了一系列細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，確定了 miR-383 與 HuR 共調(diào)控 CREPT 表達(dá)。

CREPT 蛋白在 HuR 過(guò)表達(dá)或敲降條件下的蛋白表達(dá)的柱狀圖（注：與 CMV6 組相比，**P<0.01，***P<0.001；與 NC-siRNA 組相比，#P<0.05，##P<0.01，###P<0.001）實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖 2-3A、B 所示，與 NC-siRNA 對(duì)照組相比，CREPT 蛋白在 HuRsiRNA 處理組表達(dá)量顯著降低；與 CMV6 對(duì)照組相比，CMV6-HuR 轉(zhuǎn)染組 CREPT蛋白的表達(dá)量顯著增多（P<0.01）。Elisa 實(shí)驗(yàn)結(jié)果與蛋白印跡結(jié)果相一致（圖 2-3C）。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明，在 HuR 蛋白過(guò)表達(dá)的情況下，CREPT 蛋白的表達(dá)也隨之顯著提高，說(shuō)明 HuR 在結(jié)直腸癌細(xì)胞株中對(duì) CREPT 蛋白表達(dá)存在調(diào)控作用。2.4.4 HuR對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞中CREPT mRNA表達(dá)的調(diào)控作用為了進(jìn)一步驗(yàn)證 si-HuR 是否是作用于 CREPT，并抑制 CREPT mRNA 表達(dá)，我們進(jìn)一步利用 Lipofectamine2000 轉(zhuǎn)染試劑分別將 NC-siRNA、si-HuR、CMV6、CMV6-HuR 質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至結(jié)直腸癌細(xì)胞株 HCT116β/ω，48 h 后檢測(cè)各備選 siRNA 及過(guò)表達(dá)質(zhì)粒對(duì) CREPT mRNA 表達(dá)影響。通過(guò) RNA 提取、逆轉(zhuǎn)錄、PCR 反應(yīng)及瓊脂糖凝膠電泳等一系列實(shí)驗(yàn)檢測(cè)結(jié)直腸癌中 CREPT mRNA 的表達(dá)。
【學(xué)位授予單位】：燕山大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ460.1

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本文編號(hào)：2663037