【摘要】：幾丁質(zhì)是由N-乙酰-D-氨基葡萄糖通過(guò)β-1,4-糖苷鍵連接而成的多聚合物,是地球上僅次于纖維素的第二大可再生資源。N-乙酰-D-氨基葡萄糖是幾丁質(zhì)的完全降解產(chǎn)物,其在醫(yī)藥、食品、肥料、日化和能源等方面具有廣泛的應(yīng)用價(jià)值。目前,幾丁質(zhì)降解的傳統(tǒng)方式是化學(xué)酸堿法進(jìn)行降解,而在其降解過(guò)程中存在降解產(chǎn)物不純和產(chǎn)生大量酸堿廢液等缺點(diǎn),使得幾丁質(zhì)資源未得到合理利用。而酶法降解幾丁質(zhì)是一種無(wú)污染、低成本、操作簡(jiǎn)單、產(chǎn)物易控制的高效降解方法。因此,生物酶法代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)法來(lái)生產(chǎn)N-乙酰-D-氨基葡萄糖,是具有巨大的社會(huì)、經(jīng)濟(jì)價(jià)值以及學(xué)術(shù)價(jià)值的綠色可代替方法,是社會(huì)發(fā)展的必然。由于天然幾丁質(zhì)的不溶性嚴(yán)重阻礙了酶法降解幾丁質(zhì)的效率,因此,本研究模仿了纖維小體的結(jié)構(gòu),設(shè)計(jì)了人工幾丁質(zhì)小體,它能通過(guò)蛋白支架Scaf將幾丁質(zhì)內(nèi)切酶(SaChiB)、幾丁質(zhì)外切酶(SaHex)以及裂解多糖單加氧酶(LPMO)連接起來(lái),協(xié)同降解幾丁質(zhì)小體以實(shí)現(xiàn)目的酶和底物的空間定位,進(jìn)而通過(guò)不同種類的酶來(lái)實(shí)現(xiàn)高效降解幾丁質(zhì)的目的。1、本研究根據(jù)纖維小體的模式設(shè)計(jì)了人工“幾丁質(zhì)小體”。通過(guò)Linker將幾丁質(zhì)結(jié)合結(jié)構(gòu)域(CBD)與3種不同的Cohesin連接構(gòu)成幾丁質(zhì)小體中重要的蛋白支架Scaf,Scaf不具有降解幾丁質(zhì)的活性。2、PCR擴(kuò)增三種具有協(xié)同作用的幾丁質(zhì)酶基因以及不同來(lái)源的Dockerin基因,通過(guò)無(wú)縫克隆的方法成功得到了重組質(zhì)粒pET30a(+)-LPMO-Dockerin、pET30a(+)-Dockerin-SaHex、pET30a(+)-SaChiB-Dockerin。3、將帶有重組酶基因的三種質(zhì)粒以及合成的支架蛋白Scaf轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21(DE3)中,并得到了高效表達(dá),重組蛋白及支架蛋白通過(guò)Ni-NTA純化后,等摩爾比進(jìn)行自組裝,經(jīng)Native-PAGE凝膠檢測(cè)試驗(yàn)表明,蛋白組裝成功。4、對(duì)組裝后的幾丁質(zhì)小體進(jìn)行酶學(xué)性質(zhì)試驗(yàn),結(jié)果表明其最適pH為8.0,最適溫度為30℃。通過(guò)最適酶量試驗(yàn)表明,其最適加酶量為40μM。通過(guò)幾丁質(zhì)小體與游離酶降解幾丁質(zhì)效果比較試驗(yàn)表明,在最佳反應(yīng)條件下,與游離酶組合體系相比,幾丁質(zhì)小體的降解效率提高了2.53倍。
【圖文】：

由微生物進(jìn)行分泌的幾丁質(zhì)酶種類多樣，種類不同的幾丁質(zhì)酶，它們的結(jié)構(gòu)與性質(zhì)有很大的差異，根據(jù)酶與底物發(fā)生反應(yīng)的不同位置、降解后產(chǎn)生的產(chǎn)物可以將幾丁質(zhì)酶劃分為以下三類：（1）幾丁質(zhì)內(nèi)切酶（endochitinase EC3.2.1.14）沿著幾丁質(zhì)鏈隨機(jī)進(jìn)行切割糖苷鍵，生成二聚體（二乙�；鶜ざ牵┖陀� GlcNAc 組成的可溶性低分子量多聚體，例如殼三糖和殼寡糖[16]。（2）幾丁質(zhì)外切酶（exochitinase）將幾丁質(zhì)內(nèi)切酶與幾丁質(zhì)反應(yīng)后的產(chǎn)物進(jìn)一步進(jìn)行水解反應(yīng)[16]�？煞譃閮蓚�(gè)亞類：一類是幾丁二糖酶（chitobiosidase，EC3.2.1.29），可從多糖的非還原端裂解幾丁質(zhì)或者幾丁質(zhì)寡聚物，，釋放的最終產(chǎn)物主要是二乙酰幾丁 二 糖 [(GlcNAc)2] ； 另 一 類 為 N- 乙 酰 -D- 氨 基 葡 萄 糖 苷 酶（N-acetylglucosaminidases，EC3.2.1.30），和幾丁二糖酶類似，都可從糖鏈的非還原端開(kāi)始裂解幾丁質(zhì)或幾丁質(zhì)寡聚物，生成單體 N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)，它也是唯一能水解(GlcNAc)2的酶[17-19]。N-乙酰-β-D-氨基葡萄糖苷酶大部分屬于 20 家族[20]。但是還有部分糖苷水解酶屬于 3 家族包括 Alteromonas sp. Cht60，E. coli Nag Z[22]，S.thermoviolaceus Nag A[23]，V. furnissii Exo II[24]等，均來(lái)源于微生物。

圖 3.熱纖梭菌纖維小體模型Fig.3. The architecture of the cellulosome from C. thermocellum圖 4. 熱纖梭菌 CipA 基因簇Fig.4. Cip A gene cluster from C. thermocellum人工纖維小體的構(gòu)建著纖維素小體研究的不斷深入，纖維小體在轉(zhuǎn)化纖維素晶體成可利用單了較為深入的成果。作為一種高效的纖維素降解機(jī)器，纖維素小體的人始取得成果，已經(jīng)成為研究及改造自然界中纖維素小體的有力工具。研簡(jiǎn)單、具有必備元件（支架蛋白和重組酶模塊）的微型纖維素小體(cellas; )[45]，這種纖維小體遵照了自然界中纖維小體的一般構(gòu)成規(guī)則，不同
【學(xué)位授予單位】：河北農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：TQ317

【參考文獻(xiàn)】

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1 關(guān)海寧;徐桂花;刁小琴;;微生物產(chǎn)幾丁質(zhì)酶的研究概況及其應(yīng)用[J];中國(guó)食物與營(yíng)養(yǎng);2006年08期

2 周櫻,王風(fēng)平,肖湘;豚鼠氣單胞菌CB101中幾丁質(zhì)酶基因的克隆及其異源表達(dá)的全酶蛋白和酶片段的功能研究[J];自然科學(xué)進(jìn)展;2002年08期

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1 劉海泉;嗜熱毛殼菌熱穩(wěn)定幾丁質(zhì)酶基因的克隆、表達(dá)與性質(zhì)研究[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2008年

本文編號(hào)：2658678