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磷脂酶D催化磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)生產(chǎn)稀有及非天然磷脂的研究

發(fā)布時(shí)間：2020-05-08 22:11

【摘要】：為解決稀有及非天然磷脂酶催化合成的技術(shù)難題,針對(duì)現(xiàn)有磷脂生產(chǎn)工藝,即磷脂酶D(PLD)催化的磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)中存在的生產(chǎn)效率低、選擇性低、后處理工藝復(fù)雜、產(chǎn)品安全隱患大等問題。本文主要研究方向?yàn)槊复呋磻?yīng)工程,通過磷脂酶D固定化和水-固反應(yīng)體系構(gòu)建對(duì)磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)過程進(jìn)行了系統(tǒng)深入的探究,為稀有及非天然磷脂的工業(yè)化生產(chǎn)提供理論和技術(shù)支持,保障包括“大腦維生素(磷脂酸絲氨酸,PS)”等磷脂產(chǎn)品的市場(chǎng)推廣。設(shè)計(jì)了吸附-沉淀-交聯(lián)固定化方法固定化PLD,提升該生物催化劑的催化性能。通過沉淀-吸附作用將游離酶蛋白分子附著于無孔納米二氧化硅載體表面,進(jìn)而利用分子間和分子內(nèi)交聯(lián)作用使酶蛋白分子以層狀“酶網(wǎng)”包裹固定化在納米二氧化硅載體表面,形成核(載體)殼(聚集酶)結(jié)構(gòu)的交聯(lián)酶聚集體(CS-CLEAs)。該固定化方法簡(jiǎn)便易行,所得固定化酶易于回收反復(fù)使用,且固定化效果良好。PLD固定化率達(dá)80%,固定化PLD催化磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)制備磷脂酰乙醇胺(PE)比活力達(dá)15872U/g_(protein),約為游離PLD比活力(13813U/g_(protein))的1.15倍。動(dòng)力學(xué)研究表明,PLD固定化后表現(xiàn)出更高的磷脂�；D(zhuǎn)移活力,且對(duì)磷脂底物親和性增大。同時(shí),采用該方法固定化PLD還可有效改善其pH耐受性、熱穩(wěn)定性、儲(chǔ)藏穩(wěn)定性和運(yùn)行穩(wěn)定性。為了進(jìn)一步提升吸附-沉淀-交聯(lián)固定化技術(shù)的效果,提出了結(jié)合生物印跡的核殼交聯(lián)酶聚集體固定化酶方法(CS-BI-CLEAs)。針對(duì)磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)生產(chǎn)稀有磷脂磷脂酰甘油(PG)過程,以底物甘油為配體誘導(dǎo)PLD酶蛋白形成有利于催化作用的構(gòu)象,即在“生物印跡”作用下誘導(dǎo)酶的“超活化”結(jié)構(gòu),然后以吸附-沉淀-交聯(lián)方法將“超活化”的酶分子以層狀“酶網(wǎng)”包裹固定化在納米二氧化硅載體表面,固定酶分子的“超活化”構(gòu)象,洗滌除去配體甘油后,得到生物印跡-固定化PLD。CS-BI-CLEA固定化技術(shù),可以有效僵化具有生物印跡特征的PLD酶蛋白,使其能夠在水相中依然保持有利的催化構(gòu)象,催化活力顯著提高。固定化PLD催化磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成PG的最大比活力達(dá)到166953U/g_(protein),是游離PLD合成PG時(shí)比活力(11922U/g_(protein))的14倍。同時(shí),固定化PLD的反應(yīng)選擇性也得到提升,PG的最高產(chǎn)率可以達(dá)到94.0%,副產(chǎn)物PA產(chǎn)率僅有5.96%。傳統(tǒng)的磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)采用有機(jī)溶媒-水兩相體系(Water-Organic Biphasic System),不僅污染環(huán)境、影響產(chǎn)品安全性,而且催化酶效率低、磷脂酶D回收利用困難。因此,本文提出以多孔載體表面負(fù)載磷脂底物,與水相中的酶及第二底物接觸作用,進(jìn)行水-固體系(Aqueous-solid System)磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)的方法。將不溶于水的底物磷脂酰膽堿(PC)預(yù)溶解在乙酸乙酯溶液中,加入硅膠載體后,以丙酮為沉淀劑通過吸附-沉淀作用使游離PC附著在載體表面形成載體負(fù)載化磷脂,PC負(fù)載率高達(dá)90.7%。將載體負(fù)載化PC分散于PLD、絲氨酸水溶液中進(jìn)行磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生產(chǎn)磷脂酰絲氨酸(PS)。在此水-固體系中,固相載體表面為磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的“人造界面”,當(dāng)載體表面被PC分子覆蓋后,進(jìn)行反應(yīng)的水-固界面親水性降低,為磷脂�；D(zhuǎn)移過程提供了疏水微環(huán)境,降低了水解副反應(yīng)發(fā)生的機(jī)率,提高了反應(yīng)選擇性和產(chǎn)物收率。通過系統(tǒng)探究載體PC負(fù)載量、載體空余表面積和載體孔道結(jié)構(gòu)等對(duì)磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)的影響,確定優(yōu)化條件下PS最大產(chǎn)率達(dá)99.5%。此外,水-固體系可以方便實(shí)現(xiàn)游離PLD水溶液的回收再利用,重復(fù)使用6次之后PS產(chǎn)率仍達(dá)到73.6%。之后,本文以無孔納米二氧化硅為載體進(jìn)行水-固體系磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)生產(chǎn)非天然磷脂磷脂酰γ-羥基丁酸(PB)。有效降低了PC吸附及酶催化反應(yīng)過程的傳質(zhì)阻力,提高底物PC負(fù)載率和產(chǎn)物PB收率。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,最大PC負(fù)載率達(dá)98.3%,顯著降低了原料PC的浪費(fèi)。探究了PC負(fù)載率、載體PC負(fù)載量、載體空余表面積等對(duì)磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)的影響,優(yōu)選條件下PB最大產(chǎn)率為97.3%。采用高效液相色譜(HPLC)、傅里葉變換紅外光譜(FT-IR)和飛行時(shí)間質(zhì)譜(TOF-MS)三種手段表征所合成的PB樣品。由于水-固體系PC反應(yīng)轉(zhuǎn)化率接近完全,因此,無需復(fù)雜純化過程即可獲得很高純度PB,可直接用于動(dòng)物實(shí)驗(yàn),為藥理藥效研究提供所需原料藥樣品。通過硅膠表面共價(jià)結(jié)合非離子型表面活性劑,制備具有吸附作用的功能化硅膠,可實(shí)現(xiàn)磷脂底物在水介質(zhì)中均勻吸附于硅膠表面,從而發(fā)展了直接吸附法水-固體系(Direct adsorption aqueous-solid system)磷脂�；D(zhuǎn)移反應(yīng)。采用共價(jià)結(jié)合法將辛基酚聚氧乙烯醚(曲拉通X-100)表面活性劑分子固定在四種不同規(guī)格的硅膠載體表面。通過曲拉通X-100分子長(zhǎng)碳鏈與磷脂的疏水親和作用,實(shí)現(xiàn)將水介質(zhì)中磷脂底物PC分子轉(zhuǎn)移吸附于硅膠表面。將吸附了PC的硅膠分散在水介質(zhì)中進(jìn)行磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)合成PS。在間歇式批次反應(yīng)過程中,尺寸較小的曲拉通X-100改性載體具有更好的PC吸附性能及反應(yīng)效果,最大PC負(fù)載量和PS產(chǎn)率分別達(dá)到98.9%和99.0%。研究表明,相對(duì)于團(tuán)聚狀磷脂的溶解過程,PC分子吸附過程是限速步驟。采用一步吸附模型和兩步吸附模型對(duì)PC的吸附過程進(jìn)行了理論研究,求解了相關(guān)吸附動(dòng)力學(xué)參數(shù)。兩個(gè)模型求取的PC分子在改性硅膠表面形成半膠束時(shí)的吉布斯自由能分別為-29.8 kJ/mol和-23.0kJ/mol,遠(yuǎn)小于其在水溶液中形成膠束的時(shí)的吉布斯自由能(19.5kJ/mol),同時(shí)臨界半膠束濃度(2.76×10~(-6)mol/L)也遠(yuǎn)小于臨界膠束濃度(4.36×10~(-4)mol/L)。功能化硅膠通過分子親和作用加快了水溶液中PC分子在硅膠表面的吸附速率,促使PC分子不斷溶解,從而實(shí)現(xiàn)了在水介質(zhì)中直接吸附PC。利用直接吸附法建立的水-固反應(yīng)體系,以改性硅膠載體為填料,依次以PC水溶液、酶溶液和洗脫液為流動(dòng)液,建立了PS的連續(xù)化生產(chǎn)固定床反應(yīng)工藝。小尺寸的曲拉通X-100改性載體雖然具有更高的PC吸附率和PS轉(zhuǎn)化率,但是尺寸較大的載體的時(shí)空產(chǎn)率更大。因此,綜合PC負(fù)載率、PS產(chǎn)率和時(shí)空產(chǎn)率三者的作用,尺寸為20-40目的曲拉通X-100改性硅膠(5.34×10~(-10) mol_(Triton)/g_(silica))是水-固體系連續(xù)化生產(chǎn)PS中固定床反應(yīng)器最優(yōu)填料。連續(xù)化生產(chǎn)實(shí)驗(yàn)證明曲拉通X-100共價(jià)改性的硅膠載體理化性質(zhì)十分穩(wěn)定,重復(fù)使用30次后也未顯示性能衰減。針對(duì)水-固反應(yīng)體系特點(diǎn),選用椰子油為溶劑洗脫產(chǎn)物磷脂,得到的含有磷脂酰絲氨酸(PS)的椰油溶液。以此為芯材,殼聚糖為壁材,通過水相分離法制備了含PS的微膠囊產(chǎn)品,實(shí)現(xiàn)了PS從原料生產(chǎn)到成品加工的完整工藝過程。
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磷脂酶D催化磷脂酰基轉(zhuǎn)移反應(yīng)生產(chǎn)稀有及非天然磷脂的研究