【摘要】：L-丙氨酰-L-谷氨酰胺(L-alanyl-L-glutamine,丙谷二肽)因其具有高熱穩(wěn)定性、高水溶性并且無生理毒性,常被作為L-谷氨酰胺的載體應(yīng)用于臨床。α-氨基酸酯�；D(zhuǎn)移酶(α-amino acid ester acyltransferase,AET)能夠催化底物L(fēng)-丙氨酸甲酯鹽酸鹽、L-谷氨酰胺合成丙谷二肽。本文構(gòu)建了一株產(chǎn)α-氨基酸酯�；D(zhuǎn)移酶的重組大腸桿菌,并對其發(fā)酵條件、酶學(xué)性質(zhì)及催化應(yīng)用進(jìn)行了研究。本論文首先將來源于E.brevis ATCC 14234和siyangensis AJ2458的α-氨基酸酯�；D(zhuǎn)移酶的編碼基因進(jìn)行密碼子優(yōu)化,然后經(jīng)全基因合成并將其導(dǎo)入到不同的質(zhì)粒載體,構(gòu)建了SAET-QC01、SAET-QC02、EAET-DW01三組重組菌株,其中SAET-QC01的產(chǎn)量顯著高于其他菌株,更適合α-氨基酸酯�；D(zhuǎn)移酶的表達(dá)。其次對SAET-QC01的發(fā)酵條件經(jīng)優(yōu)化確定為:甘油0.5%、胰蛋白胨0.5%、酵母浸粉1%、無水硫酸鎂0.1%、初始pH 6.3,誘導(dǎo)溫度為20℃,誘導(dǎo)初始菌濃OD_(600)=2.0-2.5,IPTG濃度為0.6 mmol/L,誘導(dǎo)時(shí)間12 h,優(yōu)化后酶活力從221.6 U/mL提升到998.0 U/m L,提高了將近5倍。通過Ni-NTA親和層析法分離純化重組蛋白,測定其分子量約為68 k Da。研究該酶的酶學(xué)性質(zhì)發(fā)現(xiàn)其最適溫度為27℃,最適p H 8.5,在p H 7.0-8.0很穩(wěn)定,在酸性條件下相對穩(wěn)定;金屬離子及化合物對該酶活力有一定的影響,在一定濃度范圍內(nèi),低濃度的Co~(2+)和低濃度的EDTA對酶活有促進(jìn)作用,高濃度的Fe~(3+),Ni~(2+),SDS對該酶有明顯的抑制作用;并測得該酶的Km和Vmax的值分別為0.30 mol/L和0.02 mol/min·g。再對其催化應(yīng)用進(jìn)行了初步的探索,利用重組α-氨基酸酯�；D(zhuǎn)移酶制備丙谷二肽,在加酶量為50 U/mmol,底物谷氨酰胺和丙氨酸甲酯鹽酸鹽的添加比例為0.8,當(dāng)丙氨酸甲酯鹽酸鹽的濃度為100 mmol/L、200 mmol/L、300 mmol/L、400 mmol/L、500 mmol/L、600 mmol/L,丙谷二肽的產(chǎn)量分別為15.1 g/L,29.2g/L、42.3 g/L、56.2 g/L、69.5 g/L、78.2 g/L,相對于谷氨酰胺的轉(zhuǎn)化率為86.7%,84.0%,81.1%,80.9%,80.0%,75.0%。最后將催化產(chǎn)物進(jìn)行初步的分離純化,并對其進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征,確定了丙谷二肽的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)。本論文研究確定α-氨基酸酯�；D(zhuǎn)移酶具有良好的酸堿耐受性,催化效率高的優(yōu)良特性,在工業(yè)生產(chǎn)中具有較好的應(yīng)用潛力。
【圖文】：

實(shí)驗(yàn)流程設(shè)計(jì)

第二章 -氨基酸酯�；D(zhuǎn)移酶重組工程菌的構(gòu)建構(gòu)建詢比對，來源于 E. brevis ATCC 14234 的2458 的編碼 SAET的基因，在構(gòu)建大腸桿達(dá)可能不適合，，所以根據(jù)大腸桿菌的密碼優(yōu)化目標(biāo)為根據(jù)大腸桿菌表達(dá)的密碼子偏等。將序列送至生工生物工程（上海）股基因合成工作。8a-SAET 的構(gòu)建程（上海）股份有限公司構(gòu)建的重組質(zhì)粒pUC57-SAET 質(zhì)粒圖譜如圖 2.1 所示。
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925;TQ464

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2642875