【摘要】：纖維素酶在食品,醫(yī)藥,紡織釀造等工業(yè)具有廣闊的應(yīng)用前景,蘊(yùn)藏著巨大的市場潛力。隨著對纖維素酶需求量的日益增大,纖維素酶生產(chǎn)周期長、活力低、生產(chǎn)成本高等問題履待解決。分子生物學(xué)技術(shù)的飛速發(fā)展使得許多基因工程操作工具已經(jīng)成功應(yīng)用于真菌系統(tǒng),里氏木霉的基因工程改造效率得到了極大地提高。然而纖維酶是一個及其復(fù)雜的酶復(fù)合體系,纖維素酶活的提高與一系列基因的表達(dá)調(diào)控息息相關(guān)。利用基因工程改造對菌株進(jìn)行改造已經(jīng)取得了一定的成果,但仍需進(jìn)一步研究來提高纖維素酶的產(chǎn)量。因此,開展纖維素酶高產(chǎn)菌株的選育工作仍然是必要的。本課題以里氏木霉RUT-C30為出發(fā)菌株,利用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)對其進(jìn)行誘變,篩選性狀優(yōu)良的高產(chǎn)纖維素酶突變菌株。對高產(chǎn)菌株進(jìn)行全基因組測序,解析其突變型。并對高產(chǎn)菌株的發(fā)酵工藝進(jìn)行優(yōu)化,為纖維素酶的工業(yè)化生產(chǎn)提供參考。主要內(nèi)容包括:1.利用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)以及剛果紅溶脹培養(yǎng)基構(gòu)建基本篩選方法,并對篩選培養(yǎng)基進(jìn)行優(yōu)化。確定了初篩培養(yǎng)基中添加乳糖0.3%(w/w)時可以明顯縮短孢子萌發(fā)時間,添加氯化鋰0.1%(w/w)可以顯著增加正突變率。利用常壓室溫等離子體誘變系統(tǒng)對里氏木霉RUT-C30進(jìn)行誘變,最終篩選得到一株濾紙酶活較高的菌株JNDY-13,其最高濾紙酶活可達(dá)2.21 IU·m L~(-1)是出發(fā)菌株RUT-C30的2.21倍。2.對纖維素酶高產(chǎn)菌株JNDY-13進(jìn)行全基因組測序,并對其突變型進(jìn)行分析。結(jié)果顯示,在JNDY-13中鑒定出752個突變,其中18個為水解酶,34個為合成酶,20個為激酶,52個與能量代謝有關(guān),73個與物質(zhì)運(yùn)輸有關(guān),38個與轉(zhuǎn)錄和翻譯有關(guān),8個與生長有關(guān),399個是假設(shè)蛋白,還有110個與其他功能相關(guān)。另外,752個SNP中的105個被確認(rèn)為點(diǎn)突變,336個為刪除突變,165個插入突變和99個混合突變。3.對半乳糖激酶的基因突變分析發(fā)現(xiàn),半乳糖激酶基因的454 bp處插入了18個堿基(非CDS區(qū)),經(jīng)過酶活測定以及RT-PCR分析發(fā)現(xiàn),相同的發(fā)酵條件下半乳糖激酶的酶活較出發(fā)菌株RUT-C30有所下降,但半乳糖激酶基因的轉(zhuǎn)錄量較RUT-C30顯著提高。半乳糖激酶基因的轉(zhuǎn)錄量和纖維素酶的產(chǎn)量相關(guān),故半乳糖激酶的基因突變可能與纖維素酶的產(chǎn)量增加相關(guān)。另外使用RT-PCR方法對JNDY-13菌株中的纖維素酶基因,半纖維素酶基因以及和纖維素酶相關(guān)的調(diào)節(jié)因子的基因的轉(zhuǎn)錄水平進(jìn)行了分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)與出發(fā)菌株相比,在對數(shù)期前期,11個纖維素酶和半纖維素酶相關(guān)基因中,有6個基因的轉(zhuǎn)錄量與原始菌株相比上調(diào)。在對數(shù)中期階段,11個纖維素酶和半纖維素酶相關(guān)基因中,有8個基因的轉(zhuǎn)錄量上調(diào)。然而在穩(wěn)定期,纖維素酶相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄與里氏木霉RUT-C30相比顯著下調(diào)。4.根據(jù)JNDY-13的特性,設(shè)計正交實(shí)驗(yàn)對產(chǎn)酶培養(yǎng)基各組分含量進(jìn)行了優(yōu)化,得到的最佳產(chǎn)酶培養(yǎng)基組成為:乳糖10 g·L~(-1),微晶纖維素10 g·L~(-1),玉米漿粉12 g·L~(-1),(NH_4)_2SO_4 1.5 g·L~(-1),MgSO_4 1.2 g·L~(-1),CaCl_2 1.4 g·L~(-1),1 mL·L~(-1) Mandels微量元素營養(yǎng)鹽,2m L·L~(-1)吐溫80,pH 4.8。用此產(chǎn)酶培養(yǎng)基發(fā)酵濾紙酶活最高可達(dá)2.64 IU·mL~(-1)。同時,設(shè)計正交實(shí)驗(yàn)對JNDY-13上罐發(fā)酵的條件進(jìn)行了優(yōu)化。得到的最優(yōu)上罐發(fā)酵條件為:發(fā)酵溫度28℃,攪拌轉(zhuǎn)速400 r·min~(-1),通氣量2 vvm,pH 5.0。在最優(yōu)發(fā)酵條件下,用高產(chǎn)菌株JNDY-13進(jìn)行分批發(fā)酵最高濾紙酶活(FPU)可達(dá)4.74 IU·mL~(-1),最高菌體含量可達(dá)8.91 g·L~(-1)。5.進(jìn)行流加發(fā)酵時,以最高濾紙酶活為標(biāo)準(zhǔn)對流加的濃縮液成分進(jìn)行了優(yōu)化。得到的最優(yōu)流加濃縮液成分為乳糖和硫酸銨(碳氮比10:1)且在最優(yōu)發(fā)酵條件下進(jìn)行流加發(fā)酵時濾紙酶活最高可達(dá)5.40 IU·mL~(-1),菌濃最高可達(dá)9.19 g·L~(-1)。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：TQ925

【參考文獻(xiàn)】

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1 何敏超;許敬亮;袁振宏;孔曉英;張宇;陳小燕;梁翠誼;;纖維素酶基因表達(dá)研究進(jìn)展[J];林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè);2014年05期

2 趙琪;李亞蘭;陳子欣;王桃云;;纖維素酶應(yīng)用研究的最新進(jìn)展[J];廣州化工;2014年06期

3 張圣燕;張成;;纖維素酶提取冬棗葉中總黃酮工藝的研究[J];食品工業(yè)科技;2013年01期

4 滕海波;史慧敏;李穎;鄭耀麗;單曉慧;羅琳;;纖維素酶加碳酸氫鈉溶液結(jié)石內(nèi)注射并浸泡結(jié)合機(jī)械碎石治療胃結(jié)石24例[J];內(nèi)蒙古醫(yī)學(xué)雜志;2011年11期

5 許志;曾柏全;宋睿;;高產(chǎn)纖維素酶菌株篩選及誘變選育[J];中國農(nóng)學(xué)通報;2011年24期

6 顏霞;柳曉東;楊俊杰;;高溫纖維素酶產(chǎn)生菌的篩選鑒定及其酶性質(zhì)研究[J];太陽能學(xué)報;2011年06期

7 王歲樓;王海翔;;利用超高壓誘變選育食品與發(fā)酵微生物的研究進(jìn)展[J];食品科學(xué);2011年03期

8 李雪峰;侯紅萍;;選育高產(chǎn)纖維素酶菌種的研究進(jìn)展[J];釀酒科技;2010年05期

9 張喜宏;劉義波;高云航;;纖維素酶及纖維素酶產(chǎn)生菌選育的研究進(jìn)展[J];飼料工業(yè);2009年22期

10 李榮杰;;微生物誘變育種方法研究進(jìn)展[J];河北農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年10期

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1 張國秀;里氏木霉纖維素酶高產(chǎn)菌株遺傳改造及新型糖苷水解酶的挖掘[D];華東理工大學(xué);2017年

2 方浩;里氏木霉纖維二糖水解酶II基因的克隆與表達(dá)[D];浙江大學(xué);2014年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前4條

1 姜伯玲;重離子輻照誘變選育纖維素酶高產(chǎn)菌株及其發(fā)酵工藝的研究[D];中國科學(xué)院研究生院(近代物理研究所);2016年

2 張素敏;纖維素酶高產(chǎn)菌株—里氏木霉的選育及發(fā)酵生產(chǎn)條件研究[D];福州大學(xué);2013年

3 龔玉雷;纖維素酶和果膠酶復(fù)合體系在茶葉提取加工中的應(yīng)用研究[D];浙江工業(yè)大學(xué);2013年

4 許志;高產(chǎn)纖維素酶菌株選育、分子鑒定及發(fā)酵工藝研究[D];中南林業(yè)科技大學(xué);2012年

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本文編號：2633826