【摘要】：細(xì)菌感染一直威脅著人類的身心健康,為了預(yù)防和治療細(xì)菌感染所引起的疾病,人們采取了多種有效措施,但目前主要是使用抗生素類等抗菌藥物來殺滅病原體。隨著抗生素的不合理使用,出現(xiàn)了越來越多的耐藥菌株。為了應(yīng)對新出現(xiàn)的感染危機(jī),人們需要研發(fā)更多、更有效的治療方式。糖類化合物可以說是自然界中最豐富、結(jié)構(gòu)最多樣性的有機(jī)物。細(xì)胞糖萼是一層覆蓋在細(xì)胞表面的糖質(zhì),它參與細(xì)胞分化、識別、粘附,甚至包括病理發(fā)展等多種生物過程。細(xì)菌莢膜多糖(Capsular polysaccharide,CPS)就是一類細(xì)胞糖萼,很多細(xì)菌的莢膜多糖不僅是其主要的毒力因子,莢膜多糖糖鏈結(jié)構(gòu)的差異還是細(xì)菌分型的重要依據(jù),而且很多莢膜多糖具有免疫原性、結(jié)構(gòu)高度保守性,這些特點(diǎn)使其成為研制疫苗的理想靶標(biāo)抗原。人們通過接種糖類疫苗來預(yù)防一些細(xì)菌的感染,例如肺炎鏈球菌疫苗、B型流感嗜血桿菌疫苗、C群腦膜炎球菌疫苗等都已上市應(yīng)用,相比于抗生素,這些細(xì)菌糖類疫苗疫苗可以大規(guī)模接種,且接種后可長效防護(hù)。其中肺炎鏈球菌第一代疫苗是莢膜多糖疫苗,但是,單純的莢膜多糖免疫原性較差,不能產(chǎn)生依賴于T細(xì)胞的免疫應(yīng)答。為了解決該問題,人們將莢膜多糖與免疫原性較強(qiáng)的載體蛋白進(jìn)行共價(jià)連接制備多糖蛋白綴合物,發(fā)展了第二代多糖結(jié)合疫苗。但上述兩代細(xì)菌疫苗的多糖來源均為細(xì)菌提取,獲得的莢膜多糖存在微觀不均一、制備的糖蛋白綴合物存在質(zhì)量不易控制等缺點(diǎn),為了克服這些缺點(diǎn),人們通過化學(xué)手段合成結(jié)構(gòu)明確、糖鏈長短不一的莢膜多糖寡糖抗原,進(jìn)而與載體蛋白相連制備糖蛋白綴合物,發(fā)展了第三代半合成疫苗,并且通過構(gòu)效關(guān)系的研究,可確定出最佳的寡糖抗原結(jié)構(gòu)。肺炎鏈球菌3型(SP3)是強(qiáng)致病性的亞型之一,它可引起成人侵襲性肺炎球菌病、壞死性肺炎和急性中耳炎。盡管SP3 CPS已經(jīng)在肺炎十三價(jià)多糖結(jié)合疫苗(PCV13)中存在,但其CPS綴合物表現(xiàn)出較低的免疫球蛋白G(IgG)響應(yīng),影響了整個(gè)PCV13的保護(hù)功效。因此,本論文一個(gè)主要研究內(nèi)容是以肺炎鏈球菌3型莢膜多糖為研究對象,制備系列具有明確抗原結(jié)構(gòu)特征的SP3寡糖蛋白綴合物用于免疫活性評價(jià):設(shè)計(jì)與合成了四個(gè)含有肺炎鏈球菌3型莢膜多糖重復(fù)片段的寡糖抗原(五、六、七、八糖);并將寡糖抗原與破傷風(fēng)類毒素(TT)綴合得到寡糖蛋白綴合物候選疫苗;最后對制備綴合物的免疫活性和構(gòu)效關(guān)系進(jìn)行了初步的研究。研究還發(fā)現(xiàn),許多細(xì)菌之所以致病,是由其分泌的成孔毒素引起的。這些成孔毒素是由細(xì)菌分泌產(chǎn)生的毒蛋白,它不僅僅是細(xì)菌的主要毒力和致病因子,還參與了細(xì)菌的生長和發(fā)育等過程。包括氣單胞菌溶素和CAMP因子在內(nèi)的成孔毒素能在宿主細(xì)胞表面形成孔狀聚合物,并嵌入細(xì)胞膜內(nèi)形成小孔,從而破壞細(xì)胞滲透屏障,導(dǎo)致反向離子交換和其他致命反應(yīng),最終殺死宿主細(xì)胞并導(dǎo)致疾病。但大多數(shù)的成孔毒素是親水性的蛋白,并不含有明顯的成孔結(jié)構(gòu),為了建立跨膜孔,成孔毒素通常與宿主細(xì)胞表面的糖基磷脂酰肌醇(GPI)結(jié)合,從而形成孔狀聚合物,并將聚合物插入至細(xì)胞膜中形成小孔。而GPI錨是一類天然糖脂,普遍存在于真核生物中,它通過將自身的脂質(zhì)部分插入細(xì)胞膜的方式將蛋白質(zhì)或糖蛋白固定在細(xì)胞表面。前期的研究結(jié)果表明,成孔毒素CAMP因子既能與GPI結(jié)合,又能與GPI結(jié)構(gòu)片段結(jié)合,并且不含磷酸甘油脂的GPI衍生物能夠抑制由CAMP因子導(dǎo)致的綿羊紅細(xì)胞溶血現(xiàn)象。鑒于此,本論文另一個(gè)主要研究內(nèi)容是篩選有效的基于GPI結(jié)構(gòu)的成孔毒素抑制劑,主要包括:設(shè)計(jì)與合成一系列基于GPI結(jié)構(gòu)的不同大小結(jié)構(gòu)特征的衍生物;設(shè)計(jì)合成了基于氟硼二吡咯(BODIPY)熒光染料為標(biāo)記探針的GPI衍生物,用于成孔毒素抑制劑的篩選。本論文主要包括以下三個(gè)部分:一、對肺炎鏈球菌3型莢膜多糖寡糖衍生物以及熒光或生物素標(biāo)記的GPI錨衍生物的合成研究做了詳細(xì)綜述。肺炎鏈球菌3型莢膜多糖重復(fù)片段是由一分子糖醛酸和一分子葡萄糖以β-(1→4)鍵相連組成的二糖,由于分子中含有糖醛酸,其寡糖合成分為兩種方式.①通過合理的保護(hù)基操作和組裝策略,直接使用糖醛酸模塊來構(gòu)建糖鏈,最后脫除全部保護(hù)基得到目標(biāo)化合物;②全部使用葡萄糖模塊來構(gòu)建糖鏈,然后選擇性地裸露出需要轉(zhuǎn)化為糖醛酸的葡萄糖模塊6-OH,最后一步將所有的羥亞甲基(CH2OH)氧化為羧基(COOH)來實(shí)現(xiàn)糖醛酸的引入。而對于熒光或生物素標(biāo)記的GPI錨衍生物的合成,主要是熒光分子或生物素衍生物中含有竣基,與GPI錨結(jié)構(gòu)中額外的氨基以酰胺鍵相連,由于GPI錨結(jié)構(gòu)中含有一分子氨基葡萄糖,在熒光分子或生物素與GPI錨縮合之前,氨基葡萄糖上自由的2-氨基先采用Boc保護(hù)基團(tuán)保護(hù),最后Boc保護(hù)基在縮合反應(yīng)后用強(qiáng)酸脫除得到目標(biāo)化合物。二、肺炎鏈球菌3型莢膜多糖相關(guān)寡糖及其蛋白綴合物的合成和免疫活性評價(jià)。我們以D-葡萄糖為起始原料,利用預(yù)活化糖苷化方法,首先構(gòu)建了關(guān)鍵中間體二糖SP-10,利用SP-10來獲得其他二糖和三糖模塊,同時(shí)SP-10還起到延伸糖鏈的作用。通過[3+2]、[4+2]、[3+4]、[4+4]的組裝策略成功構(gòu)建了全保護(hù)五、六、七、八糖糖鏈,合成過程中充分利用苯甲酰基的鄰基參與作用立體專一性地生成β糖苷鍵。選擇性地裸露出葡萄糖基6-OH,一步將葡萄糖殘基氧化成葡萄糖醛酸殘基,最后脫除保護(hù)基得到目標(biāo)化合物SP-(1-4)。通過交聯(lián)劑琥珀酰亞胺戊二酸醋,SP-(1-4)分別與載體蛋白BSA和TT共價(jià)綴合得到一系列寡糖蛋白綴合物,其載糖量是通過基質(zhì)輔助激光解吸飛行時(shí)間(MALDF-TOF)質(zhì)譜儀測定載體蛋白綴合前后分子量的差值計(jì)算得來。SP3寡糖蛋白綴合物的初步免疫活性結(jié)果表明,它們都能引起依賴于T細(xì)胞的免疫應(yīng)答,產(chǎn)生IgG抗體,并且五、六糖蛋白綴合物的免疫效果要顯著強(qiáng)于七、八糖蛋白綴合物的免疫效果。三、GPI熒光標(biāo)記物和基于GPI結(jié)構(gòu)的成孔毒素抑制劑合成。我們分別以D-氨基葡萄糖和α-甲苷葡萄糖為起始原料,制得氨基葡萄糖供體GI-24和光學(xué)純肌醇受體GI-38,進(jìn)而偶聯(lián)得到底座偽二糖GI-40。與此同時(shí),以D-甘露糖為起始原料制備了甘露三糖供體GI-56。隨后,采用[3+2]組裝策略構(gòu)建了全保護(hù)GPI核心偽五糖GI-57,緊接著在其Man-Ⅲ的6-O位引入磷酸乙醇胺、將氨基葡萄糖2-氨基以Boc保護(hù)基保護(hù),催化氫化后的產(chǎn)物GI-62與含有羧酸長鏈的BODIPY衍生物GI-66在HATU[2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N',-四甲基脲六氟磷酸鹽]作用下縮合。可惜的是,用酸性選擇脫除Boc保護(hù)基的同時(shí)終產(chǎn)物失去了熒光性。我們又將Boc保護(hù)基替換成堿性脫除的Fmoc保護(hù)基,成功制得GPI熒光標(biāo)記物GI-14和15。另一方面,以D-甘露糖為起始原料制備了Man-I的2-O位含有乙酰基的甘露單、二、三糖硫苷供體(GI-46、86、89),然后采用[1+2]、[2+2]、[3+2]組裝策略構(gòu)建了偽三、四、五糖(GI-90、95、100),脫除Man-1 2-O位乙�；蚣〈�1-O位對甲氧基芐基,緊接著磷酸乙醇胺化或單磷酸化。與此同時(shí),將光學(xué)純肌醇模塊和偽二糖模塊結(jié)構(gòu)中肌醇1-OH單磷酸化,最后脫除保護(hù)基得到了一系列含有不同官能團(tuán)、糖鏈長短不一的GPI衍生物GI-(1-13)。上述制備系列GPI化合物GI-(1-13)和兩種GPI熒光探針GI-14、15為篩選有效的成孔毒素的抑制劑奠定物質(zhì)基礎(chǔ)。
【圖文】：

而所有的蛋白或糖蛋白通過其肽鏈的Ｃ－端與ＧＰＩ描中甘露糖－ＩＩＩ上的６－０的逡逑磷酸乙醇胺的氨基以酰胺鍵相連，［６７］這樣ＧＰＩ錨將蛋白或糖蛋白描定在相應(yīng)的細(xì)逡逑胞膜表面（圖１．９）。逡逑Ｈ邐0邋＋／－邋Ｓｕｇａｒ逡逑Ｐｒｏｔｅｉｎ邋Ｎ＾＾0＿Ｈ＿0￣逡逑。？ｏ0＾＾Ｍａ？，ｎ逡逑Ｈ０、ｉ逡逑Ｈ0邋＾＾ｉ－0，邋Ｍａｎ－ｌｌ邋＋／－邋Ｐｈｏｓｐｈｏｅｔｈａｎｏｌａｍｉｎｅ逡逑＋／－邋Ｓｕｇａｒ邋＝５－邋ｈｏ邐＾逡逑0邋Ｍａｎ－１逡逑？／？Ｓｕｇａｒ邋０邐，0ｈ邐＋／－Ｆａｔｔｙ邋ａｃｉｄ逡逑ＧＪｃＮ邋Ｕ逡逑ＨＯ邋ＯＨ逡逑ｈ３ｎ邐ｉｎｏｓｉｔｏｌ逡逑Ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ邐0＝ｐ－0—Ｎ邐ｌｉｐｉｄｓ逡逑ｆｆｆ麗|!R鍘Ｆ遠(yuǎn)義希茫澹懾危殄澹五澹灣澹懾澹灣澹″澹桑懾澹灣澹澹澹歟殄澹懾澹懾澹灣澹灣義希恚澹恚猓潁幔睿邋澹赍澹靛澹煎澹灣澹，

本文編號：2621279