【摘要】：L-鳥氨酸是一種非必需氨基酸,在食品和醫(yī)藥等領(lǐng)域有廣泛的應(yīng)用。谷氨酸棒桿菌是L-鳥氨酸的常用生產(chǎn)菌株。N-乙酰-γ-谷氨酰磷酸脫氫酶(argC)在谷氨酸棒桿菌中是L-鳥氨酸生物合成途徑中argCJBD基因簇的第一個(gè)酶。過表達(dá)argC可增強(qiáng)L-鳥氨酸末端生物合成途徑,從而提高L-鳥氨酸生物合成途徑的流量,使L-鳥氨酸大量積累、產(chǎn)量提高。谷氨酸棒桿菌野生菌株的L-鳥氨酸產(chǎn)量為8.86±0.15 g·L-1,在替換高強(qiáng)度啟動序列后,L-鳥氨酸產(chǎn)量達(dá)10.50±0.03 g·L-1,為野生型的118%,產(chǎn)量提升明顯。本研究將谷氨酸棒桿菌S9114菌株發(fā)酵培養(yǎng)12 h的樣品進(jìn)行蛋白質(zhì)組學(xué)分析,以其豐度值作為內(nèi)源性啟動序列的篩選依據(jù),篩選獲得16個(gè)不同強(qiáng)度的啟動序列。將其連接增強(qiáng)型綠色熒光蛋白并在谷氨酸棒桿菌中進(jìn)行表達(dá)。經(jīng)過對熒光強(qiáng)度進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn),熒光強(qiáng)度值分布在52.0 RFU/OD到5966.8 RFU/OD中,變化范圍超過100倍,其中最強(qiáng)啟動序列的啟動強(qiáng)度為Ptac啟動子的3.3倍。選擇其中8個(gè)啟動序列替換argC基因的啟動序列并將替換菌株進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)和產(chǎn)量測定,結(jié)果發(fā)現(xiàn)隨啟動強(qiáng)度的增加L-鳥氨酸產(chǎn)量從0.87±0.04 g·L-1增加至10.50±0.03 g·L-1,即產(chǎn)量隨argCJBD基因簇表達(dá)量的提高而提高。最強(qiáng)的PC624 05210啟動序列的替換菌株的L-鳥氨酸產(chǎn)量是野生型的118%。本實(shí)驗(yàn)從谷氨酸棒桿菌S9114中篩選并驗(yàn)證了 16個(gè)不同強(qiáng)度的啟動序列,為谷氨酸棒桿菌的代謝調(diào)控提供了豐富的控制元件,也為L-鳥氨酸的增產(chǎn)打下了堅(jiān)實(shí)的基礎(chǔ)。酶的理性設(shè)計(jì)可以使用數(shù)個(gè)堿基的突變帶來酶性質(zhì)的巨大改變,這種對基因組修飾極少即可控制代謝的方法在代謝工程方面有很廣闊的應(yīng)用前景。為了給后續(xù)的改造奠定方法基礎(chǔ),本研究開展了酶的理性設(shè)計(jì)工作。通過計(jì)算機(jī)輔助的模擬篩選和人工篩選,得到兩個(gè)酶活分別提高2.5和2.1倍的突變體。通過結(jié)構(gòu)分析發(fā)現(xiàn),突變削弱了催化位點(diǎn)上方蓋狀結(jié)構(gòu)的密封能力,使催化中心露出從而導(dǎo)致催化效率變高。該實(shí)驗(yàn)為酶的改造提供了新的設(shè)計(jì)策略。
【圖文】：

華東理工大學(xué)碩士學(xué)位論文邐第３頁逡逑方程式如圖１．１所示。逡逑ＮＨ邐０邐Ｏ逡逑＋邋…。二邋Ｈ２Ｎ－＾＾０Ｈ邋＇Ａ．逡逑ｎｈ２邐ｎｈ２逡逑／．－ａｒｇｉｎｉｎｅ邐Ｌ－ｏｍｉｔｈｉｎｅ邐Ｕｒｅａ逡逑圖１．１酶水解ｌ－精氨酸逡逑Ｆｉｇ．邋１．１邋Ｅｎｚｙｍａｔｉｃ邋ｈｙｄｒｏｌｙｓｉｓ邋ｏｆ邋Ｚ－ａｒｇｉｎｉｎｅ逡逑酶水解法生產(chǎn)ｉ－鳥氨酸具有催化速度快、產(chǎn)物專一性強(qiáng)、副產(chǎn)物少、轉(zhuǎn)化效率高逡逑的優(yōu)點(diǎn)，得到的產(chǎn)物后續(xù)的分離、純化步驟簡單，目前應(yīng)用較多。張鵬等人篩選獲得逡逑一株糞腸球菌，其具有較高的Ｌ－精氨酸酶活性，應(yīng)用到酶水解法中可以得到１１２邋ｇｉ－１逡逑的鳥氨酸產(chǎn)量ｎ３］。但目前ｉ：－精氨酸酶的提取工藝復(fù)雜，且Ｉ－精氨酸的價(jià)格相對高昂，逡逑這些因素都使得生產(chǎn)成本處于較高的水平，生產(chǎn)方法價(jià)格優(yōu)勢不明顯。逡逑１．１．４．４微生物發(fā)酵法生產(chǎn)Ｌ－鳥氨酸逡逑目前常用的鳥氨酸生產(chǎn)方法為微生物發(fā)酵法。此法相比化學(xué)合成法具有生產(chǎn)過逡逑程安全、產(chǎn)物單一、對自然友好的特點(diǎn)。相比酶水解法具有原料成本低廉、生產(chǎn)材料逡逑方便可得的特點(diǎn)。除此之外，發(fā)酵法還具有設(shè)備要求低、反應(yīng)條件溫和、分離純化簡逡逑單的優(yōu)點(diǎn)，這些優(yōu)勢都明顯降低了生產(chǎn)成本，利于大規(guī)模生產(chǎn)。至今，許多微生物都逡逑被發(fā)現(xiàn)可以積累鳥氨酸，例如，谷氨酸棒桿菌、石蠟節(jié)桿菌、大腸桿菌等，其中谷逡逑氨酸棒桿菌的研究較多

物有銅綠假單胞菌、硫化裂片菌以及大腸桿菌等。逡逑大腸桿菌中由谷氨酸合成Ｌ鳥氨酸包含五步線性反應(yīng)，，編碼這些酶的基因包括逡逑ｆｌｒｇＪ、ａｒｇＣ、ａｒｇＤ和詳細(xì)途徑見圖１．３。在此途徑中Ｚ－鳥氨酸的代謝受逡逑到兩方面的調(diào)節(jié)，途徑的最終產(chǎn)物精氨酸可以激活調(diào)控蛋白ｗｇ／？，阻止谷氨酸支路逡逑基因的表達(dá)；同時(shí)Ｌ－精氨酸可以抑制＃ｇ兒使支路流量降低。逡逑［邋Ｇｌｕｔａｍａｔｅ逡逑Ｘ邋ｐｒｏＢ＾邋一＾＼逡逑／邋Ｇｌｕｔａｍｙｌ邋ｐｈｏｓｐｈａｔｅ邐Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｇｌｕｔａｍａｔｅ邐＼逡逑／邋丨邐ｉ邋ａｒ？Ｂ邋＼逡逑／邋Ｇｌｕｔａｍａｔｅ邋ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ邐Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｇｌｕｔａｍｙｌ－Ｐ邐＼逡逑／邐Ｉ邐ｉ邋ａｒｇＣ邐＼逡逑ｙ邐Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｇｌｕｔａｍａｔｅ邐＼逡逑Ｐｙｒｏｌｉｎｅ－５－ｃａｒｂｏｘｙｌａｔｅ邐ｓｅｍｉａｌｄｅｈｙｄｅ逡逑ｐｒ0Ｃ邋｜邐ｊ邋ａｒｇＤ邐Ｉ逡逑ＶＰｒｏｌｉｎｅ邐Ｎ－Ａｃｅｔｙｌ邋ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ邐／逡逑ｉ邋ａｒｇＥ邐／逡逑￡－Ｏｎｉｉ邋ｔｉｌｉｎｇ邋：■＞］逡逑ｉ邋ａｒｇＦＩ邋ｙ逡逑Ｃｉｔｒｕｌｉｎｅ逡逑ｉ邋ａｒｇＧＨＸ逡逑Ａｒｇｉｎｉｎｅ＾＾逡逑圖１．３大腸桿菌中Ｌ－鳥氨酸的代謝途徑逡逑Ｆｉｇ．邋１．３邋Ｂｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓ邋ｐａｔｈｗａｙ邋ｏｆ邋Ｌ－ｏｒｎｉｔｈｉｎｅ邋ｉｎ邋Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ邋ｃｏｌｉ．逡逑谷氨酸棒桿菌中ｉ－谷氨酸合成ａ－鳥氨酸需要經(jīng)過四種酶的催化。其中％乙酰谷氨逡逑酸的生成是由具有雙功能的ａｒｇｊ編碼的酶完成的，是典型的循環(huán)途徑ＷＩ。具體代謝途逡逑徑參見圖１．４。在此代謝途徑中
【學(xué)位授予單位】：華東理工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ922

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本文編號：2615475