【摘要】：3-羥基丁酮是一種具有特殊的奶油香氣的平臺化學(xué)品,廣泛應(yīng)用于食品添加劑、制藥和化工等領(lǐng)域。微生物發(fā)酵法生產(chǎn)3-羥基丁酮由于滿足可持續(xù)發(fā)展理念而日益受到矚目。多數(shù)芽孢桿菌作為一般認為安全的(GRAS)菌株具有天然合成3-羥基丁酮的代謝路徑,但其產(chǎn)量由于菌株耐受性等因素的限制還不能達到工業(yè)化制備的要求。本研究通過結(jié)合進化工程策略和代謝工程方法,對解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)進行傳統(tǒng)復(fù)合誘變、自主適應(yīng)性進化,強化了3-羥基丁酮的耐受表型,提高了工程菌株3-羥基丁酮的生產(chǎn)性能。主要研究內(nèi)容如下:1.高產(chǎn)3-羥基丁酮芽孢桿菌的傳統(tǒng)突變選育。采用常壓室溫等離子體(ARTP)和~(60)Coγ射線對B.amyloliquefaciens FMME088進行復(fù)合誘變,以3-羥基丁酮產(chǎn)量為分析指標(biāo),通過搖瓶水平的兩輪篩選獲得最優(yōu)突變株B.amyloliquefaciens H-5,3-羥基丁酮產(chǎn)量為68.2 g·L~(-1)。為實現(xiàn)3-羥基丁酮的高效生產(chǎn),進一步對此突變株進行5-L發(fā)酵罐水平的培養(yǎng)條件優(yōu)化,并于30-L發(fā)酵罐上進行放大培養(yǎng),最終3-羥基丁酮產(chǎn)量達85.2 g·L~(-1),較出發(fā)菌株B.amyloliquefaciens FMME088提高了26.8%。2.自主進化突變系統(tǒng)(AEMS)的設(shè)計與構(gòu)建。首先,為了確定啟動子P_(srfA)是否滿足群體感應(yīng)(quorum sensing,QS)的自誘導(dǎo)性能,在B.subtilis 168中表達了由P_(srfA)啟動的增強型綠色熒光蛋白(EGFP),其熒光表達強度隨細胞生長狀態(tài)的變化而變化,并在細胞生長至對數(shù)中后期(8~12 h),OD_(600)為1.0~2.2時表達顯著增加。其次,為了提高啟動子P_(srfA)的轉(zhuǎn)錄活性,使用保守序列TTGACA和TATAAT替換P_(srfA)的-35區(qū)和-10區(qū),通過檢測熒光表達強度發(fā)現(xiàn),由-35區(qū)被替換的啟動子P_(TH11)啟動的EGFP熒光強度提高了40%。另外,對P_(TH11)的上游序列進行不同長度的截斷,其中P_(JD15)(-136~+291)啟動的EGFP熒光強度最大,提高了48%。第三,為了實現(xiàn)對啟動子P_(JD15)的精細調(diào)控以及減輕泄漏表達,將啟動子P_(JD15)和木糖操縱子相結(jié)合,設(shè)計了由細胞密度和木糖共同誘導(dǎo)的雜合啟動子P_(srfA)xylO~m。為了擴展其調(diào)控范圍,結(jié)合由IPTG誘導(dǎo)的雜合啟動子P_(grac)lacO,構(gòu)建了分層動態(tài)調(diào)控系統(tǒng),并借助蛋白酶降解過程的SspB連接蛋白和ssrA標(biāo)簽,實現(xiàn)單一層級的自我調(diào)控和雙層級間的轉(zhuǎn)換調(diào)控。第四,以3-羥基丁酮的耐受性為檢驗指標(biāo),研究損傷修復(fù)基因(mutL、alkA、mutS和mutH)的缺失和重組修復(fù)基因(recA、ssbA、bstG、polY1)的過表達對B.subtilis 168在適應(yīng)性進化中突變頻率的影響。結(jié)果表明,雙基因mutL、alkA敲除菌株B.subtilis HS114和雙基因ssbA、bstG過表達菌株B.subtilis HS119突變頻率較B.subtilis 168分別提高了14.6倍和26.5倍。因此,選擇mutL和alkA作為高保真模塊(HFM),選擇ssbA和bstG作為突變模塊(MUM)。最后,將HFM和MUM與分層動態(tài)調(diào)控系統(tǒng)相結(jié)合,借助啟動子P_(grac)lacO調(diào)控HFM和P_(srfA)xylO~m調(diào)控MUM,構(gòu)建自主進化突變系統(tǒng)(AEMS)。3.自主進化突變系統(tǒng)(AEMS)的應(yīng)用。首先,將AEMS應(yīng)用于適應(yīng)性進化篩選3-羥基丁酮耐受性表型,以60 g·L~(-1) 3-羥基丁酮作為篩選壓力,細胞存活率作為篩選指標(biāo),正突變率達到了44.8%,獲得最優(yōu)耐受性突變株HS013。其次,將AEMS應(yīng)用于適應(yīng)性進化篩選3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株。在HS013中過表達3-羥基丁酮生物合成路徑上的三個關(guān)鍵酶——6-磷酸果糖激酶(PFKA)、α-乙酰乳酸合成酶(ALS)和α-乙酰乳酸脫羧酶(ALDC),獲得重組菌株B.subtilis HS014。在此基礎(chǔ)上,利用AEMS對HS014進行適應(yīng)性進化,以3-羥基丁酮產(chǎn)量作為篩選指標(biāo),篩選獲得最優(yōu)突變株B.subtilis HS016,3-羥基丁酮產(chǎn)量達到64.5 g·L~(-1)。再次在HS016中,進一步過表達正向調(diào)控3-羥基丁酮合成的轉(zhuǎn)錄調(diào)控子CcpA和AlsR,并利用AEMS進行自主進化,篩選獲得3-羥基丁酮高產(chǎn)菌株B.subtilis HS019,3-羥基丁酮產(chǎn)量達到76.3 g·L~(-1)。最后,在5-L發(fā)酵罐中對突變株HS019進行分批補料培養(yǎng),3-羥基丁酮的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強度分別為69.2 g·L~(-1)、0.39 g·g~(-1)和1.33 g·(L·h)~(-1)。另外,將HS019進行30-L發(fā)酵罐的擴大培養(yǎng),3-羥基丁酮的產(chǎn)量、產(chǎn)率和生產(chǎn)強度分別達到82.5 g·L~(-1),0.46 g·g~(-1)和1.59 g·(L·h)~(-1),與5-L發(fā)酵罐水平相比,分別增加了19.2%,17.5%和19.3%。
【圖文】：

1-1 3-羥基丁酮的結(jié)構(gòu)式-1 Chemical structure of aceto 種平臺化學(xué)品之一，，根據(jù)于一般認為安全的（GRA、香草、核桃、朗姆酒、，3-羥基丁酮通常用于烘域中的應(yīng)用外，3-羥基丁基丁酮沸點適中（148oC一種中性非離子化合物化妝品，肥皂，乳液等的用于合成雜環(huán)化合物 2,3,5

的比例發(fā)生一定程度的提高，NAD生成能力下降，從而影響細胞的能。目前，為減輕輔因子循環(huán)失衡引起的負面影響，多數(shù)研究選擇采用X 來催化多余的 NADH 轉(zhuǎn)化為 NAD+，維持微生物的正常生長于代酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）為宿主菌株，在刪除了五個乙醇DH2、ADH3、ADH4、ADH5）和兩個甘油 3-磷酸脫氫酶（GPD1、過過表達來源于乳酸乳球菌（Lactococcus lactis）的成水 NADH 氧化再生，成功地緩解了葡萄糖發(fā)酵生產(chǎn) 3-羥基丁酮的過程中出現(xiàn)的輔因株 JHY617-SDN 在分批補料發(fā)酵中生產(chǎn) 3-羥基丁酮 100.1 g·L-1，產(chǎn)率ang 等利用代謝工程策略調(diào)控 NADH 水平，在四個候選酶中成功地篩化酶 YODC，在已經(jīng)敲除 bdhA 基因的 B. subtilis 中適度表達 YOD配到 3-羥基丁酮，使得 3-羥基丁酮的產(chǎn)量提高至 56.7 g·L-1，增加了醇、乳酸和乙醇的生成量分別減少了 92.3%、70.1%和 75.0%，并且發(fā)倍[13]。綜合上述案例，在引入 3-羥基丁酮合成路徑和阻斷 3-羥基丁酮徑的同時，引入 NADH 氧化酶能夠很好的解決大部分微生物在生產(chǎn)中還原力過剩的問題，從而改善菌株生長并提高 3-羥基丁酮產(chǎn)量。
【學(xué)位授予單位】：江南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：TQ929

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前2條

1 劉曉霏;付晶;霍廣鑫;章博;王智文;陳濤;;生物法制備平臺化合物乙偶姻的最新研究進展[J];中國生物工程雜志;2015年10期

2 馬紅武;劉會娟;朱年青;陳濤;;代謝工程方法改造谷氨酸棒狀桿菌生產(chǎn)乙偶姻[J];天津大學(xué)學(xué)報(自然科學(xué)與工程技術(shù)版);2014年11期

本文編號：2605312