類胡蘿卜素是一類對植物和人體健康非常重要的次生代謝物。盡管類胡蘿卜素代謝研究已經(jīng)取得了很大的進展,但是關于類胡蘿卜素代謝調控的分子機理還不夠清晰。柑橘果實含有豐富的類胡蘿卜素,并且類胡蘿卜素含量和組成決定了果實外觀品質、營養(yǎng)價值和經(jīng)濟效益。因此,研究柑橘類胡蘿卜素代謝具有重要的理論和實踐意義。番茄紅素β-環(huán)化酶（LCYb）是位于類胡蘿卜素合成途徑分支點的關鍵酶。大量研究表明,LCYb基因表達水平與類胡蘿卜素含量和組成密切相關。但是,關于LCYb基因表達的轉錄調控機制還未知,在柑橘乃至整個植物界中還沒有轉錄因子被證明能直接調控其表達。因此,本研究以柑橘LCYb基因為切入點,深入分析該基因表達模式、序列多態(tài)性以及酶活性特點;并克隆和鑒定該基因啟動子序列、表達活性及其關鍵順式作用元件;進一步利用酵母單雜交系統(tǒng),篩選可能與LCYb啟動子互作的轉錄因子;采用遺傳學、分子生物學和生物化學等方法,驗證候選轉錄因子參與類胡蘿卜素代謝的轉錄調控功能。主要研究結果如下:1.LCYb基因功能分析。大多數(shù)柑橘品種含有2種類型的LCYb基因,并且每種類型又含有2個不同的等位基因（LCYb1a、LCYb1b、LC... 

【文章來源】：華中農(nóng)業(yè)大學湖北省 211工程院校 教育部直屬院校

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【學位級別】：博士

【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
縮略詞表
第一章 前言
    1 課題的提出
    2 植物類胡蘿卜素代謝研究進展
        2.1 類胡蘿卜素簡介
        2.2 植物類胡蘿卜素代謝
            2.2.1 植物類胡蘿卜素代謝途徑
            2.2.2 植物類胡蘿卜素代謝途徑上主要結構基因
            2.2.3 影響植物類胡蘿卜素代謝的因素
        2.3 植物類胡蘿卜素代謝的分子調控
            2.3.1 轉錄水平調控
            2.3.2 其他分子水平調控
        2.4 柑橘類胡蘿卜素代謝研究進展
            2.4.1 柑橘類胡蘿卜素代謝
            2.4.2 柑橘類胡蘿卜素代謝與番茄紅素β-環(huán)化酶基因
    3 本研究的目的和內容
第二章 柑橘LCYb基因功能分析
    1 引言
    2 材料和方法
        2.1 實驗材料
        2.2 實驗方法
            2.2.1 DNA提取、RNA提取及cDNA合成
            2.2.2 基因克隆及序列分析
            2.2.3 實時定量PCR
            2.2.4 原核表達載體構建及工程菌實驗
            2.2.5 細菌類胡蘿卜素提取及測定
            2.2.6 點突變
    3 結果與分析
        3.1 甜橙LCYb基因表達分析
        3.2 不同柑橘品種LCYb2基因序列的等位多態(tài)性分析
        3.3 不同柑橘品種LCYb2環(huán)化酶活性分析
        3.4 甜橙2個LCYb2等位基因的點突變分析
    4 討論
        4.1 柑橘中LCYb2基因的重要作用
        4.2 柑橘LCYb2基因的等位多態(tài)性與不同柑橘品種的進化關系有關
        4.3 72 位和359位氨基酸是影響LCYb2酶活性的關鍵位點
第三章 柑橘LCYb啟動子的克隆和活性分析
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
        2.2 實驗方法
            2.2.1 DNA提取
            2.2.2 啟動子克隆
            2.2.3 啟動子序列生物信息學分析
            2.2.4 啟動子表達載體構建
            2.2.5 農(nóng)桿菌介導的番茄果實瞬時轉化
            2.2.6 農(nóng)桿菌介導的擬南芥穩(wěn)定轉化
            2.2.7 農(nóng)桿菌介導的柑橘愈傷組織穩(wěn)定轉化
            2.2.8 外源因子處理
            2.2.9 GUS定性定量檢測
            2.2.10 簡單序列重復(SSR)標記
            2.2.11 數(shù)據(jù)分析
    3 結果與分析
        3.1 甜橙CsLCYb1啟動子序列分析
        3.2 瞬時表達番茄果實中CsLCYb1啟動子活性分析
        3.3 穩(wěn)定轉化擬南芥植株中CsLCYb1啟動子活性分析
            3.3.1 CsLCYb1不同啟動子缺失片段的組織特異性活性分析
            3.3.2 CsLCYb1全長啟動子在轉基因擬南芥不同發(fā)育時期的活性分析
            3.3.3 CsLCYb1不同啟動子缺失片段在轉基因擬南芥中的活性比較
        3.4 穩(wěn)定轉化柑橘愈傷組織中CsLCYb1啟動子活性分析
            3.4.1 CsLCYb1不同啟動子缺失片段在轉基因愈傷中的活性比較
            3.4.2 CsLCYb1不同啟動子缺失片段響應外源因子處理的活性變化
        3.5 CsLCYb1啟動子精細缺失分析
        3.6 其他柑橘品種LCYb1啟動子序列分析
        3.7 甜橙CsLCYb2啟動子序列分析
        3.8 瞬時表達番茄果實中CsLCYb2啟動子活性分析
    4 討論
        4.1 CsLCYb1不同啟動子缺失片段表達特點
        4.2 CsLCYb1啟動子響應不同外源和內源因子的表達特點
        4.3 一個新的增強子元件與CsLCYb1啟動子活性密切相關
        4.4 不同柑橘品種LCYb1啟動子上增強子元件拷貝數(shù)差異
        4.5 CsLCYb2啟動子分析為等位基因差異表達的分子機制研究奠定了基礎
第四章 柑橘LCYb啟動子互作因子的篩選
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 酵母菌株及質粒
            2.1.2 酵母實驗中所使用的主要試劑
        2.2 實驗方法
            2.2.1 酵母培養(yǎng)基及溶液配方
            2.2.2 構建誘餌載體pAbAi-Bait
            2.2.3 獲得誘餌酵母菌株Y1HGold[pAbAi-Bait]
            2.2.4 檢測誘餌酵母菌株的AbA最佳使用濃度
            2.2.5 構建cDNA文庫
            2.2.6 酵母單雜交篩選文庫
            2.2.7 陽性克隆再篩選及測序分析
    3 結果與分析
        3.1 誘餌質粒pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb的構建
        3.2 誘餌菌株Y1H[pAbAi-LP/C2P1/Ya/Yb]的獲得
        3.3 檢測4個誘餌酵母菌株的AbA最佳使用濃度
        3.4 甜橙果實cDNA文庫構建
        3.5 cDNA文庫篩選
        3.6 陽性克隆的序列分析
    4 討論
        4.1 酵母單雜交系統(tǒng)探討
        4.2 篩選的幾個候選轉錄因子生物學功能探討
第五章 候選轉錄因子CsMADS6、CsMADS5和CsGARP4的功能分析
    1 引言
    2 材料與方法
        2.1 實驗材料
            2.1.1 植物材料
            2.1.2 菌株、質粒和載體
        2.2 實驗方法
            2.2.1 RNA提取及cDNA合成
            2.2.2 基因克隆及序列分析
            2.2.3 實時定量PCR
            2.2.4 蛋白提取和Westernblot分析
            2.2.5 亞細胞定位
            2.2.6 酵母單雜(Y1H)
            2.2.7 酵母雙雜(Y2H)
            2.2.8 凝膠阻滯實驗(EMSA)
            2.2.9 雙分子熒光互補實驗(BiFC)
            2.2.10 煙草瞬時表達及雙熒光素酶檢測
            2.2.11 農(nóng)桿菌介導的柑橘愈傷組織遺傳轉化
            2.2.12 農(nóng)桿菌介導的番茄遺傳轉化
            2.2.13 轉基因材料陽性系的鑒定
            2.2.14 透射電鏡(TEM)
            2.2.15 類胡蘿卜素提取及測定
            2.2.16 葉綠素提取及測定
            2.2.17 花青素提取及測定
            2.2.18 磷含量提取及測定
            2.2.19 RNA文庫構建及測序
            2.2.20 數(shù)據(jù)分析
    3 轉錄因子CsMADS6的結果與分析
        3.1 CsMADS6基因序列和蛋白特性分析
        3.2 CsMADS6基因表達分析
        3.3 CsMADS6蛋白亞細胞定位
        3.4 CsMADS6蛋白轉錄活性分析
        3.5 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動子互作分析
            3.5.1 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動子互作的Y1H驗證
            3.5.2 CsMADS6蛋白與LCYb1啟動子互作的EMSA驗證
            3.5.3 CsMADS6蛋白對LCYb1啟動子活性的影響
        3.6 柑橘愈傷CsMADS6超表達系類胡蘿卜素含量及基因表達分析
            3.6.1 柑橘愈傷CsMADS6超表達系的獲得和表型分析
            3.6.2 柑橘愈傷CsMADS6超表達系類胡蘿卜素含量分析
            3.6.3 柑橘愈傷CsMADS6超表達系類胡蘿卜素基因表達分析
            3.6.4 柑橘愈傷CsMADS6超表達系類胡蘿卜素相關TFs表達分析
        3.7 CsMADS6蛋白與其他類胡蘿卜素基因啟動子互作分析
            3.7.1 CsMADS6蛋白與PSY、PDS和CCD1啟動子互作的EMSA驗證
            3.7.2 CsMADS6蛋白對PSY、PDS和CCD1啟動子活性的影響
        3.8 番茄CsMADS6超表達系表型及生理生化分析
            3.8.1 番茄CsMADS6超表達系的獲得和表型分析
            3.8.2 番茄CsMADS6超表達系果皮和萼片類胡蘿卜素含量分析
            3.8.3 番茄CsMADS6超表達系果皮和萼片質體超微結構分析
            3.8.4 番茄CsMADS6超表達系果皮和萼片類胡蘿卜素基因表達分析
            3.8.5 番茄CsMADS6超表達系萼片RNA-seq全基因組轉錄水平分析
    4 轉錄因子CsMADS5的結果與分析
        4.1 CsMADS5基因序列和表達分析
        4.2 CsMADS5蛋白亞細胞定位
        4.3 CsMADS5蛋白轉錄活性分析
        4.4 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動子互作分析
            4.4.1 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動子互作的Y1H驗證
            4.4.2 CsMADS5蛋白與LCYb1啟動子互作的EMSA驗證
            4.4.3 CsMADS5蛋白對LCYb1啟動子活性的影響
        4.5 柑橘愈傷CsMADS5超表達系類胡蘿卜素含量及基因表達分析
            4.5.1 柑橘愈傷CsMADS5超表達系的獲得和表型分析
            4.5.2 柑橘愈傷CsMADS5超表達系類胡蘿卜素含量分析
            4.5.3 柑橘愈傷CsMADS5超表達系類胡蘿卜素基因表達分析
        4.6 CsMADS5蛋白與其他類胡蘿卜素基因啟動子互作分析
            4.6.1 CsMADS5蛋白與PSY、PDS和CCD1啟動子互作的EMSA驗證
            4.6.2 CsMADS5蛋白對PSY、PDS和CCD1啟動子活性的影響
        4.7 番茄CsMADS5超表達系類胡蘿卜素含量及基因表達分析
            4.7.1 番茄CsMADS5超表達系的獲得和表型分析
            4.7.2 番茄CsMADS5超表達系果實中類胡蘿卜素含量分析
            4.7.3 番茄CsMADS5超表達系果實中類胡蘿卜素基因表達分析
        4.8 CsMADS6與CsMADS5蛋白互作分析
    5 轉錄因子CsGARP4的結果與分析
        5.1 CsGARP4基因序列和蛋白特性分析
        5.2 CsGARP4基因表達分析
        5.3 CsGARP4蛋白亞細胞定位
        5.4 CsGARP4蛋白轉錄活性分析
        5.5 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動子互作分析
            5.5.1 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動子互作的Y1H驗證
            5.5.2 CsGARP4蛋白與LCYb1啟動子互作的EMSA驗證
            5.5.3 CsGARP4蛋白對LCYb1啟動子活性的影響
        5.6 番茄CsGARP4超表達系表型及生理生化分析
            5.6.1 番茄CsGARP4超表達系的獲得和表型分析
            5.6.2 番茄CsGARP4超表達系葉片中CsGARP4及其同源基因表達分析
            5.6.3 番茄CsGARP4超表達系葉片中類胡蘿卜素含量及基因表達分析
            5.6.4 番茄CsGARP4超表達系葉片中花青素、葉綠素含量及基因表達分析
            5.6.5 番茄CsGARP4超表達系葉片中磷含量及磷饑餓相關基因表達分析
    6 討論
        6.1 CsMADS6和CsMADS5是LCYb1直接正調控因子
        6.2 CsMADS6和CsMADS5通過直接調控LCYb1、PSY、PDS和CCD1,從而協(xié)同調控類胡蘿卜素代謝
        6.3 CsMADS6重排轉錄網(wǎng)絡,引導代謝流特異進入類胡蘿卜素代謝通路
        6.4 CsGARP4可能的轉錄調控機理
第六章 總結與展望
參考文獻
附錄 I 部分實驗方法
    方法S1 DNA提取
    方法S2 RNA提取
    方法S3 cDNA合成
    方法S4 qRT-PCR
    方法S5 農(nóng)桿菌感受態(tài)制備及轉化
    方法S6 酵母感受態(tài)制備及轉化
    方法S7 雙熒光素酶檢測方法
    方法S8 類胡蘿卜素提取和測定
附錄 Ⅱ部分實驗結果
附錄 III 博士期間發(fā)表論文
致謝


【參考文獻】：
博士論文
[1]GABA支路調控柑橘果實檸檬酸代謝的機理研究[D]. 盛玲.華中農(nóng)業(yè)大學 2017
[2]水稻干旱響應中表觀調控以及OsbZIP23介導的轉錄調控的研究[D]. 宗偉.華中農(nóng)業(yè)大學 2016
[3]轉基因調控柑橘類胡蘿卜素積累的細胞學和代謝研究[D]. 曹洪波.華中農(nóng)業(yè)大學 2012
[4]甜橙（Citrus sinensis Osbeck）紅肉突變體類胡蘿卜素合成相關基因的克隆與特性分析[D]. 陶能國.華中農(nóng)業(yè)大學 2006
[5]柑橘體細胞胞質遺傳及葉綠體SSR引物開發(fā)研究[D]. 程運江.華中農(nóng)業(yè)大學 2004
[6]幾個柑桔產(chǎn)區(qū)果實色澤評價及紅肉臍橙（Citrus sinensis L.cv.Cara cara）果肉呈色機理初探[D]. 徐娟.華中農(nóng)業(yè)大學 2002

碩士論文
[1]柑橘原生質體瞬時轉化體系的建立及應用[D]. 楊威.華中農(nóng)業(yè)大學 2016



本文編號：3168258