花色素苷是使植物體組織呈現(xiàn)紅至紫色的主要物質(zhì),常因各種環(huán)境脅迫誘導(dǎo)而在植物葉片上合成積累,因而具有植物逆境脅迫的“指示劑”之稱。通過轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)的發(fā)展,我們可以深入探究低溫誘導(dǎo)和高光誘導(dǎo)的花色素苷合成機(jī)制中的差別部分和相同部分。本文我們以四季秋海棠‘超級(jí)奧林匹克’為研究材料,對(duì)不同條件下(正常生長(zhǎng)條件CK、高光條件HL和低溫條件LT)四季秋海棠葉片進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序。根據(jù)測(cè)序結(jié)果,共獲得21.09Gb Clean Data,各樣品Clean Data均達(dá)到6.73Gb,Q30堿基百分比在92.10%及以上。低溫處理和高光處理分別獲得74,779和83,699條unigene,其平均長(zhǎng)度分別684pb和640pb。低溫組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中transcript和unigene的N50值分別為2,200和1,249pb,高光組轉(zhuǎn)錄組測(cè)序中transcript和unigene的N50值分別為2,113和1,098pb。進(jìn)行基于Unigene庫(kù)的基因結(jié)構(gòu)分析,其中SSR分析共獲得6,567個(gè)SSR標(biāo)記,同時(shí)還進(jìn)行了CDS預(yù)測(cè)和SNP分析;分別通過5個(gè)蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(kù)(Nr、Swiss-Prot、KEGG、COG和GO數(shù)據(jù)庫(kù))對(duì)基因進(jìn)行功能注釋,共獲得54,799條Unigene的注釋結(jié)果,并發(fā)現(xiàn):低溫和高光均誘導(dǎo)次生代謝途徑的轉(zhuǎn)錄因子和合成基因上調(diào)表達(dá),但是二者作用的機(jī)理并不盡相同:低溫通過碳代謝到氨基酸生物途徑到苯丙素生物合成進(jìn)入花色素苷合成途徑,而高光是通過蛋白質(zhì)生物合成至類黃酮生物合成途徑再到花色素苷合成途徑;高光主要誘導(dǎo)次生代謝途徑中的花色素苷合成,而低溫在誘導(dǎo)花色素苷合成的同時(shí)也誘導(dǎo)了木質(zhì)素和原花色素(proanthocyanidins)的合成。兩組轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中的差異基因涉及花色素苷生物合成、轉(zhuǎn)移運(yùn)輸和調(diào)控等方面的生物過程。本研究是第一次對(duì)秋海棠進(jìn)行大規(guī)模基因表達(dá)的檢測(cè)。從上述轉(zhuǎn)錄組測(cè)序的數(shù)據(jù)中發(fā)現(xiàn),低溫在誘導(dǎo)花色素苷合成相關(guān)的基因(PAL、4CL、CHS、F3H、ANS和3GT)表達(dá)的同時(shí),BsRbohD基因(Rboh家族的其他基因沒有變化)也應(yīng)激顯著上調(diào)。因此用生物信息學(xué)方法對(duì)其cDNA序列及推測(cè)氨基酸序列進(jìn)了行分析。對(duì)低溫下BsRbohD基因進(jìn)行qRT-PCR分析,結(jié)果表明,BsRbohD基因在低溫處理3h后即開始顯著上調(diào)表達(dá),并于第9h達(dá)到高峰;而幾個(gè)關(guān)鍵的花色素苷合成基因(BsPAL、BsCHS、BsF3H和BsANS)則分別在低溫處理5h、7h、7h和9h后開始顯著上調(diào),并于第9h達(dá)到最高峰。初步表明BsRbohD基因介導(dǎo)的H_2O_2的信號(hào)作用可能介入了低溫引起的花色素苷合成過程;為了更進(jìn)一步驗(yàn)證此推論,分別用H_2O_2、MV、低溫下施加NADPH氧化酶的底物NADPH、NADPH氧化酶的抑制劑DPI、H_2O_2的清除劑DMTU等處理四季秋海棠葉片,結(jié)果表明:低溫、H_2O_2、MV顯著促進(jìn)了植物體內(nèi)H_2O_2含量和O_2.~-產(chǎn)生速率,同時(shí)BsRbohD、BsPAL、BsCHS、BsF3H和BsANS基因的表達(dá)顯著上調(diào),最終導(dǎo)致積累了顯著的、肉眼可見的花色素苷;低溫下施加NADPH氧化酶的底物NADPH加劇了上述ROS的產(chǎn)生,相關(guān)基因的表達(dá)和花色素苷含量的增加;而低溫下施加NADPH氧化酶的抑制劑DPI、H_2O_2的清除劑DMTU則通過減少ROS的產(chǎn)生和相關(guān)基因的表達(dá)而降低了花色素苷的合成。因此,推測(cè)低溫通過BsRbohD基因產(chǎn)生的ROS誘導(dǎo)了四季秋海棠葉片花色素苷的合成。
【學(xué)位單位】：河南農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位年份】：2018
【中圖分類】：S682.19
【部分圖文】：

圖 1 四季秋海棠葉片對(duì)照 CK（control plants）、高光 HL（high light-treated plants）和低溫 LT（lowtemperature-treated plants）三個(gè)處理的表型（a）;三個(gè)處理的葉片中花色素苷含量（b）Figure 1 Phenotypes (a) and anthocyanin contents (b) in the leaves of B. semperflorens under differentenvironmental conditions. LT, low temperature-treated plants; HL, high light-treated plants; CK,control plants在進(jìn)行測(cè)序及質(zhì)量檢查之后，低質(zhì)量的數(shù)據(jù)被篩除，在 LT、HL 和 CK 組中分別獲得25,022,374、23,025,183 和 22,506,321 組純凈序列。三組樣品中的 Q30 所占?jí)A基比分別為92.10%、94.16%和 94.07%。Clean Data 被組裝后 CK 和 HL 組中得到的 Transcript 為 177,196 條，Unigene 為 83,699條。其中 contig 長(zhǎng)度主要分布在 200-300bp，序列數(shù)量為 8,191,478；Transcript 與 Unigene的 N50 分別為 2,113bp 和 1,098bp，組裝完整性較高；Transcript 和 Unigene 的平均長(zhǎng)度為1,233bp 和 640bp。而 CK 和 LT 組中得到的 Transcript 為 174,352 條，Unigene 為 74,779 條，其中 contig 長(zhǎng)度主要分布在 200-300bp，序列數(shù)量為 9,984,407 條；Transcript 與 Unigene 的N50 分別為 2,200bp 和 1,249bp，組裝完整性較高；Transcript 與 Unigene 的平均長(zhǎng)度為 1,312bp 和 684bp（表 2）。

圖 2 差異表達(dá)基因 GO 二級(jí)節(jié)點(diǎn)注釋統(tǒng)計(jì)圖re 2 GO classification of common DEGs that were detected in both comparisons of LT vs. CK and HL in B. semperflorens leaves.橫坐標(biāo)為 GO 功能分類，分為生物進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程和分子進(jìn)程，縱坐標(biāo)左邊為基因數(shù)目所占百分為基因數(shù)目。

圖 2 差異表達(dá)基因 GO 二級(jí)節(jié)點(diǎn)注釋統(tǒng)計(jì)圖re 2 GO classification of common DEGs that were detected in both comparisons of LT vs. CK and HL vs. CKin B. semperflorens leaves.橫坐標(biāo)為 GO 功能分類，分為生物進(jìn)程、細(xì)胞進(jìn)程和分子進(jìn)程，縱坐標(biāo)左邊為基因數(shù)目所占百分比，為基因數(shù)目。
【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2885647