光周期誘導新鐵炮百合成花轉(zhuǎn)變的分子機理研究

發(fā)布時間：2020-11-02 13:58

　　百合(Lilium)是全球花卉交易市場上重要的高品質(zhì)切花,新鐵炮百合(Lilium×formolongi)是百合屬中十分罕見的播種繁殖一年開花的優(yōu)良品種,這一珍貴的開花特性對于百合的花期改良育種十分重要。之前的研究表明,光周期對新鐵炮百合成花轉(zhuǎn)變的影響十分顯著。但由于百合屬植物基因組龐大,遺傳背景十分復雜,目前百合的成花調(diào)控分子機理尚不十分清楚。因此,探究光周期誘導新鐵炮百合成花轉(zhuǎn)變的分子機理具有下列重要意義:從光周期途徑揭示了新鐵炮百合“早熟開花”的分子遺傳調(diào)控機理,縮短育種周期,為培養(yǎng)短生育期的百合新品種提供分子理論基礎(chǔ);闡明了百合光周期成花誘導的分子機理,構(gòu)建了基因調(diào)控網(wǎng)絡;為百合的成花遺傳調(diào)控分子機理研究增加寶貴的基因數(shù)據(jù)資源。本研究在分析表型性狀、解剖結(jié)構(gòu)和基因表達等指標的基礎(chǔ)上,確定了長日照下新鐵炮百合成花誘導過程中的關(guān)鍵節(jié)點。并利用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù),構(gòu)建了新鐵炮百合成花誘導的基因調(diào)控網(wǎng)絡,挖掘了一些光周期成花誘導的重要調(diào)控基因。并且重點對新鐵炮百合CONSTANS-LIKE(COL)基因家族的8個成員進行了序列進化、轉(zhuǎn)錄表達及功能驗證研究,確定了起關(guān)鍵成花誘導作用的LfCOLs成員。主要研究結(jié)果如下:(1)新鐵炮百合實生苗是兼性長日照植物。長日照條件極大促進了新鐵炮百合的成花轉(zhuǎn)變,植株開花時間比短日照條件下早近4個月,開花率高60-70%。新鐵炮百合一年開花的性狀遺傳自親本臺灣百合(L.formosanum),另一親本麝香百合(L.longiflorum)在一年的生長周期中不能開花。新鐵炮百合對光周期敏感的開花特性是可以遺傳的,獲得了新鐵炮百合自交系花期分離群體,其中早花群體的花期平均比中花群體早1個月,比晚花群體早2個月。此花期分離群體是今后研究新鐵炮百合光周期成花誘導分子機制的優(yōu)良群體材料(2)通過表型性狀調(diào)查,莖尖石蠟切片解剖形態(tài)觀察以及CONSTANSCO/FLOWERING LOCUS T(CO/F)同源基因的晝夜節(jié)律表達情況,確定了長日照條件下,新鐵炮百合成花轉(zhuǎn)變過程的關(guān)鍵時期及形態(tài)指標,包括幼齡期(播種后至7-8片葉)、誘導期(抽葶前后)、成年期(5-6節(jié)間)及分化期(9-10節(jié)間)。在莖尖尚處于營養(yǎng)生長狀態(tài)時,CO/FT同源基因的晝夜節(jié)律表達模式可作為新鐵炮百合進入成花誘導期的重要分子指標。(3)幼齡期、誘導期、成年期和分化期葉片和莖尖轉(zhuǎn)錄組測序共獲得52,824條高質(zhì)量的Unigene序列,其中33,652條(63.71%)Unigene獲得了功能注釋。四個時期的表達譜共獲得了 37,032個差異表達基因,大部分差異表達基因顯著呈現(xiàn)出從幼齡期至誘導期上調(diào)表達,誘導期至成年期下調(diào)表達,成年期至分化期再次上調(diào)表達的時空表達模式。本次測序一共發(fā)現(xiàn)了 87個與成花相關(guān)的同源基因,其中52個編碼轉(zhuǎn)錄因子,包括 bHLH,bZIP,RAV,MYB,Dof,CO-like,MADS-box 等轉(zhuǎn)錄因子家族。這些成花相關(guān)的差異表達基因分布在6條成花調(diào)控途徑中,有41個(48.8%)屬于光周期成花調(diào)控途徑。其中包括重要的成花調(diào)控因子GIGANTEA(GI),COL,FT等。在此基礎(chǔ)上,構(gòu)建了新鐵炮百合成花誘導的基因調(diào)控網(wǎng)絡。(4)利用RACE技術(shù)鑒定得到了 8個LfCOL基因家族成員的編碼區(qū)全長,根據(jù)蛋白氨基酸序列保守結(jié)構(gòu)域的不同,可以分為3類,類型Ⅰ為LfCOL5,具有兩個B-boxes保守結(jié)構(gòu)域;類型 Ⅱ 包括LfCOL6,LfCOL7,LfCOL13,LjCOL14,LfCOL15和LfCOL16,具有一個B-box保守結(jié)構(gòu)域;類型Ⅲ是LfCOL9,具有一個正常的B-box保守結(jié)構(gòu)域,以及一個二級結(jié)構(gòu)發(fā)生改變的B-box保守結(jié)構(gòu)域。其中LfCOL5與擬南芥CO基因同源性最近,保守結(jié)構(gòu)域結(jié)構(gòu)也最為相似。(5)8個LfCOL基因家族成員及LfFT1基因在不同光周期條件下的時期表達及晝夜表達模式結(jié)果表明,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9、LfFT1在長日照條件下新鐵炮百合成花誘導期高表達,但在短日照條件下呈現(xiàn)截然不同的時期表達模式。并且,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9在長、短日照條件下都連續(xù)三天呈現(xiàn)有規(guī)律的晝夜振蕩表達模式,長日照條件下,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9的晝夜節(jié)律表達模式與擬南芥CO基因一致。試驗結(jié)果表明新鐵炮百合長、短日照條件下的成花誘導遺傳調(diào)控機制不同,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9基因可能在長日照成花誘導中發(fā)揮重要作用。(6)分別構(gòu)建了L、j℃OL5LfCOL6、LfCOL9基因的植物表達載體,利用農(nóng)桿菌花序侵染法轉(zhuǎn)化擬南芥co晚花突變體,結(jié)果表明,LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9都能夠促進擬南芥晚花突變體提前開花,轉(zhuǎn)LfCOLs基因的株系,平均開花時間比co晚花突變體早12-13天,比野生型早6-7天;平均蓮座葉數(shù)目比co晚花突變體少12-14片,比野生型少5-6片。并且,轉(zhuǎn)Lf℃OLs基因的株系剛抽葶時葉片中AtFT基因的表達水平都高于擬南芥co突變體。因此確定LfCOL5、LfCOL6、LfCOL9基因是長日照誘導新鐵炮百合成花轉(zhuǎn)變的重要促進因子。尤其是LfCOL6、LfCOL9基因是新鐵炮百合中特有的能促進成花誘導的基因。體現(xiàn)了新鐵炮百合LfCOL基因家族在系統(tǒng)發(fā)育、進化及基因功能方面具有特異性。以上研究結(jié)果對闡釋光周期誘導新鐵炮百合成花轉(zhuǎn)變的分子機理具有重要的理論意義,獲得的開花關(guān)鍵基因,對百合花期改良分子育種及培養(yǎng)生育期短的百合新品種具有重要的實際應用價值。
【學位單位】：北京林業(yè)大學
【學位級別】：博士
【學位年份】：2017
【中圖分類】：S682.29
【部分圖文】：

模式圖,基因遺傳,擬南芥,模式圖

?Ｕｊｓ???（Ｔｕｒｃｋ?ｅｔ?ａｌ．，２００８）。在莖尖，ＦＴ?蛋白質(zhì)與?ｂＺＩＰ?轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子?ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ?ＬＯＣＵＳ?Ｄ??（ＦＤ）共同作用，并促進ＭＡＤＳ－ｂｏｘ轉(zhuǎn)錄因子基因ａＦ??ＯＶＥＲＥＸＰＲＥＳＳＩＯＮ?ＯＦ?ＣＯＮＳＴＡＮＳ?１?（ＳＯＣＰ）、ＡＰＩ、ＦＲＵＩＴＦＵＬＬ（ＦＵＬ）的轟達，隊??而調(diào)控成花轉(zhuǎn)變及花器官發(fā)育〇＾＾６１３１．，２００５；＼＾§８６?６１３１．，２００５）（圖１－１）。但是尸７??基因的表達同時也受到了幾個調(diào)控因子的抑制，這些抑制因子通過不同的作用機制和??成花調(diào)控途徑抑制，７＇的表達，從而阻止植物過早的開花（丫３１？６１＆１．，２００９）（圖１－１）。??這些抑制因子包括ＲＡＶ轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子ＴＥＭＰＲＡＮＩＬＬＯ?１?（ＴＥＭ１）、ＴＥＭＰＲＡＮＩＬＬＯ?２??（ＴＥＭ２），具有?ＡＰＥＴＡＬＡ２?（ＡＰ２）結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)?ＴＡＲＧＥＴ?ＯＦ?ＥＡＴ?１－３?（ＴＯＥ１－３）、??ＳＣＨＬＡＦＭＵＴＺＥ?（ＳＭＺ）及?ＳＣＨＮＡＲＣＨＺＡＰＦＥＮ?（ＳＮＺ）?（Ａｕｋｅｒｍａｎ?ａｎｄ?Ｓａｋａｉ，?２００３；??Ｊｕｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２００７；?Ｍａｔｈｉｅｕ?ｅｔ?ａｌ．，?２００９）。以及具有?ＭＡＤＳ?結(jié)構(gòu)域的轉(zhuǎn)錄因子??ＦＬＯＷＥＲＩＮＧ?ＬＯＣＵＳ?Ｃ?（ＦＬＣ）?（Ｓｃｈｍｉｄ?ｅｔ?ａｌ．，２００３）（圖?１－１）。??

晝夜節(jié)律,光周期,途徑,時分

促進ＣＤＦ１的蛋白質(zhì)的降解，從而解除ＣＤＦ１對Ｃ０的抑制作用，在一天中的傍晚出??現(xiàn)表達高峰（Ｆｏｍａｒａ?ｅｔ?ａｌ．，２００９；?Ｓａｗａ?ｅｔ?ａｌ．，?２００７）（圖１－３Ａ）。但是在短日照條件下，??黎明后１０－１２?ｈ己經(jīng)進入黑暗條件，ＧＩ不能與ＦＫＦ２形成蛋白復合物，ＣＯ基因受到??ＣＤＦ１的抑制作用，因此在傍晚時分不能出現(xiàn)高峰（Ａｎｄｒ６ｓ?ａｎｄ?Ｃｏｕｐｌａｎｄ，?２０１２）。??ＣＯ基因在傍晚時分出現(xiàn)的轉(zhuǎn)錄表達高峰對維持ＣＯ蛋白質(zhì)的穩(wěn)定非常重要。在??夜間黑暗條件下，ＣＯ蛋白質(zhì)會被ＣＯＮＳＴＩＴＵＴＩＶＥ?ＰＨＯＴＯＭＯＲＰＨＯＧＥＮＩＣ?１??（ＣＯＰｌ）－ＳＵＰＰＲＥＳＳＯＲ?ＯＦ?ＰＨＹＴＯＣＨＲＯＭＥ?Ａ（ＳＰＡ１）泛素連接酶復合物降解，因此??基因在黑暗條件下出現(xiàn)的表達高峰并不能維持ＣＯ蛋白質(zhì)的穩(wěn)定（Ａｎｄｒｄｓ?ａｎｄ??Ｃｏｕｐｌａｎｄ，?２０１２）（圖１－３Ｃ）。在傍晚時分，光照條件下，光敏色素基因能夠解除ＣＯＰ１－??ＳＰＡ１復合物對ＣＯ蛋白質(zhì)的降解作用。隱花色素受體ＣＲＹＰＴＯＣＨＲＯＭＥ?２?（ＣＲＹ２）（藍??光受體）與ＣＯＰ１相互作用，并且抑制ＣＯＰ１的表達（Ｗａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，２００１；?Ｙａｎｇ?ｅｔ?ａｌ．，?２０００；??Ｚｕｏ?ｅｔ?ａｌ．，２０１１），光敏色素受體ＰＨＹＡ?（遠紅光受體）也能對ＣＯＰ１－ＳＰＡ１復合物起到??抑制作用（圖１－３Ｃ）。同時，ＦＫＦ１在光照下也能與ＣＯ蛋白質(zhì)互相作用，增強ＣＯ蛋??白的穩(wěn)定性（Ｓｏｎｇ?ｅｔａｌ．，２０１２）。因此只有長日照條件下，基因在傍晚時分出現(xiàn)的表??達高峰能維持ＣＯ蛋白質(zhì)的穩(wěn)定，并進一步促進廠７基因的表達，從而誘導開花。??

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