桂花(Osmanthus fragrans)隸屬于木犀科木犀屬(Osmanthus),又名九里香,是一種常綠闊葉的觀賞性喬木,植株較矮,也是我國的傳統(tǒng)名花之一。桂花在漢代就有人工種植的記載,在我國南方各省區(qū)均有野生和大面積人工種植的桂花。桂花具有獨特的芳香氣味,自古以來被廣泛應(yīng)用,如食品、香料、制茶、藥用等。另外,桂花在我國文化中有著美好的象征意義。經(jīng)過長時間的自然生長和人工栽培,桂花出現(xiàn)了許多不同的品種,分四個品種群:丹桂、銀桂、金桂和四季桂。在桂花的長期進化過程中,通過產(chǎn)生各種類型的次生代謝產(chǎn)物,桂花逐漸形成了一些抵御外界不良環(huán)境的獨特功能。這些次生代謝產(chǎn)物,在植物的整體代謝活動中占據(jù)著十分重要的地位,同時又能夠留在植物體內(nèi)以便抵御一些病原微生物等外界物質(zhì)的侵害。本研究以銀桂品種白潔和橙紅丹桂盛花期的花瓣為材料,通過生理生化和分子生物學(xué)的方法,研究桂花的類黃酮代謝途徑,主要研究結(jié)果如下:(1)利用分光光度法和高效液相色譜技術(shù)對白潔和橙紅丹桂2個品種盛花期花瓣中總黃酮和槲皮素含量進行分析檢測,比較這兩種桂花品種花瓣中類黃酮和槲皮素積累量。通過檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn),白潔花瓣中的類黃酮和槲皮素含量顯著高于橙紅丹桂。(2)利用RT-PCR和熒光定量PCR檢測類黃酮代謝途徑中相關(guān)基因的表達量,發(fā)現(xiàn)相比較橙紅丹桂,白潔花瓣中類黃酮代謝途徑上游基因PAL、CHS、F3H和FLS的表達量明顯上調(diào),而下游基因DFR和ANS表達量出現(xiàn)下調(diào)。這種基因表達量上的差異會導(dǎo)致白潔花瓣中類黃酮的積累。(3)構(gòu)建35S-OfMYB1-GFP-NOS重組載體,轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌,侵染桂花花瓣,提取RNA后,用RT-PCR和熒光定量PCR檢測類黃酮代謝途徑中相關(guān)基因的表達量,結(jié)果顯示:OfMYB1基因超表達后,促進了PAL、CHI、FLS基因表達量的上調(diào),而基因DFR、ANS基因表達量出現(xiàn)了下調(diào)。說明OfMYB1可能調(diào)控了這些基因的表達。(4)酵母單雜交實驗發(fā)現(xiàn)將pB42AD-ofMYB1和pLacZi-MBP重組質(zhì)粒共轉(zhuǎn)化酵母后,培養(yǎng)后,經(jīng)過Z-buffer/X-gal染色后顯藍(lán)色,而對照共轉(zhuǎn)化pB42AD和pLacZi-MBP重組質(zhì)粒,經(jīng)培養(yǎng)和顯色后并不顯藍(lán)色,這一結(jié)果表明,OfMYB1能夠與OfPAL基因啟動子區(qū)域的MYBPLANT元件相互作用,說明OfMYB1可能參與了PAL基因表達的調(diào)控。(5)構(gòu)建原核蛋白表達載體pET-30a-OfMYB1,轉(zhuǎn)入BL21感受態(tài)細(xì)胞中,經(jīng)培養(yǎng)和誘導(dǎo)后,提取蛋白,聚丙烯酰胺凝膠電泳可以看到有25KD大小的OfMYB1蛋白目的條帶,而且隨誘導(dǎo)時間的延長,蛋白量明顯增多。
【學(xué)位單位】：河南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位年份】：2017
【中圖分類】：S685.13
【文章目錄】：
摘要
ABSTRACT
1 緒論
    1.1 類黃酮研究進展
    1.2 類黃酮的基本結(jié)構(gòu)和分類
    1.3 類黃酮的生物學(xué)功能
        1.3.1 類黃酮對植物本身的作用
        1.3.2 對人類健康的作用
    1.4 類黃酮次生代謝的基本途徑
    1.5 類黃酮代謝過程中的酶
    1.6 轉(zhuǎn)錄因子
    1.7 酵母單雜交實驗
    1.8 研究目的及意義
2 白潔和橙紅丹桂類黃酮含量分析
    2.1 實驗材料
        2.1.1 植物材料
        2.1.2 實驗試劑和儀器
    2.2 試驗方法
        2.2.1 桂花花瓣中類黃酮的提取
        2.2.2 溶液的配制
        2.2.3 色譜條件
    2.3 結(jié)果與分析
        2.3.1 繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)線性方程
        2.3.2 桂花總黃酮含量測定
        2.3.3 槲皮素標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制
        2.3.4 槲皮素含量的分析
    2.4 討論
3 類黃酮代謝途徑相關(guān)基因的表達分析
    3.1 實驗材料
        3.1.1 植物材料處理
        3.1.2 實驗試劑
        3.1.3 所用引物序列
    3.2 試驗方法
        3.2.1 桂花花瓣RNA樣品的提取
        3.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        3.2.3 RT-PCR分析基因的相對表達量
        3.2.4 熒光定量的實驗流程
    3.3 結(jié)果與分析
        3.3.1 RT-PCR分析類黃酮代謝途徑中的相關(guān)基因表達量
        3.3.2 類黃酮代謝途徑相關(guān)基因表達量的熒光定量PCR分析
    3.4 討論
4 MYB1基因在白潔花瓣中超表達對類黃酮代謝途徑基因表達的影響
    4.1 實驗材料
        4.1.1 植物材料處理
        4.1.2 實驗試劑
        4.1.3 菌株與質(zhì)粒載體
        4.1.4 試劑和培養(yǎng)基的配制
        4.1.5 所用引物序列
    4.2 試驗方法
        4.2.1 桂花花瓣RNA樣品的提取
        4.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        4.2.3 雙鏈cDNA的合成
        4.2.4 擴增片段的回收
        4.2.5 35S-OfMYB1-GFP-NOS超表達重組載體的構(gòu)建
        4.2.6 E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備與轉(zhuǎn)化
        4.2.7 農(nóng)桿菌感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化
        4.2.8 侵染桂花實驗流程
        4.2.9 RT-PCR的實驗方法
        4.2.10 熒光定量PCR流程
    4.3 結(jié)果與分析
        4.3.1 35S-OfMYB1-GFP-NOS超表達重組載體的構(gòu)建
        4.3.2 MYB1基因相對表達量的RT-PCR分析
        4.3.3 熒光定量PCR分析MYB1基因超表達對類黃酮代謝途徑相關(guān)基因表達量的影響
    4.4 討論
5 酵母單雜交試驗驗證MYB1調(diào)控PAL基因的功能
    5.1 實驗材料
        5.1.1 植物材料
        5.1.2 質(zhì)粒載體和菌株
        5.1.3 實驗試劑
        5.1.4 實驗溶液
    5.2 實驗方法
        5.2.1 花瓣RNA的提取
        5.2.2 RNA的反轉(zhuǎn)錄
        5.2.3 元件的合成
        5.2.4 pLacZi-MBP重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.5 pB42AD-ofMYB1重組質(zhì)粒的構(gòu)建
        5.2.6 酵母感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化
        5.2.7 酵母陽性克隆的篩選
    5.3 結(jié)果與分析
        5.3.1 空質(zhì)粒pB42AD和空質(zhì)粒pLacZi的酶切結(jié)果
        5.3.2 pB42AD-ofMYB1和pLacZi-MBP重組載體的構(gòu)建
        5.3.3 酵母單雜交陽性克隆的顯色
    5.4 討論
6 OfMYB1轉(zhuǎn)錄因子的原核蛋白表達
    6.1 實驗材料
        6.1.1 植物材料
        6.1.2 質(zhì)粒載體與菌株
        6.1.3 溶液
    6.2 實驗方法
        6.2.1 BL21 （DE3）感受態(tài)細(xì)胞的制備
        6.2.2 PET30a-OfMYB1重組載體的構(gòu)建
        6.2.3 重組載體原核蛋白的誘導(dǎo)表達
        6.2.4 SDS-PAGE凝膠電泳、染色及脫色
    6.3 結(jié)果與分析
        6.3.1 pET30a-OfMYB1重組載體的構(gòu)建
        6.3.2 PET30a-OfMYB1重組蛋白的表達
    6.4 討論
結(jié)論
參考文獻
致謝
攻讀學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文目錄

【相似文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 孫桂玲;江永海;文建凡;;代謝途徑的進化[J];動物學(xué)研究;2008年04期

2 梁小莉;顏倩;閆朵芳;于月華;;小麥MYB基因的表達分析[J];現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技;2014年01期

3 戴毅;陸怡;陳云;高勇;;玉米MYB家族轉(zhuǎn)錄因子基因ZmMYB002的克隆及表達分析[J];揚州大學(xué)學(xué)報(農(nóng)業(yè)與生命科學(xué)版);2013年01期

4 陳利維;王春臺;余光輝;徐鑫;覃永華;;一個水稻MYB基因的功能初步分析[J];華中農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報;2014年04期

5 鐘巍然;柴友榮;張凱;陳曉丹;盧坤;陶瀾;;苯丙烷代謝途徑中細(xì)胞色素P450的研究[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2008年13期

6 吳春霞;;植物MYB基因研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2009年20期

7 朱美霖;姜陽;曹紅斌;;不同形態(tài)的As在代謝途徑中相互轉(zhuǎn)化的研究進展[J];安徽農(nóng)業(yè)科學(xué);2012年19期

8 周淼平;周小青;姚金保;張增艷;張鵬;楊學(xué)明;馬鴻翔;;轉(zhuǎn)MYB基因小麥耐旱性的初步分析[J];江蘇農(nóng)業(yè)學(xué)報;2013年03期

9 汪琳仙;激素[J];中國獸醫(yī)雜志;1990年06期

10 宋國琦;王興軍;趙傳志;夏晗;;胚柄特異性表達順式元件結(jié)合蛋白酵母單雜交文庫的構(gòu)建[J];農(nóng)業(yè)生物技術(shù)學(xué)報;2011年05期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前5條

1 李欣;厭氧發(fā)酵液植物營養(yǎng)物質(zhì)變化及吲哚乙酸代謝途徑解析[D];中國農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

2 王艷芳;紅花天冬氨酸代謝途徑關(guān)鍵酶基因的挖掘及功能鑒定[D];吉林農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

3 邢璐;植物激素脫落酸的受體蛋白PYL8和PYL9通過結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子MYB家族成員調(diào)控擬南芥的側(cè)根生長[D];中國科學(xué)技術(shù)大學(xué);2016年

4 張立超;小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子的功能研究[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2013年

5 黃金霞;圓葉牽�；ㄇ嗨卮x途徑的基因型變異與花色變異的進化生物學(xué)研究[D];中國科學(xué)院研究生院（植物研究所）;2006年

相關(guān)碩士學(xué)位論文 前10條

1 曹麗雅;桂花花瓣的類黃酮代謝途徑及調(diào)控[D];河南大學(xué);2017年

2 李軍;桂花不同性別雄性功能的比較[D];浙江農(nóng)林大學(xué);2017年

3 李理;植物乳桿菌γ-氨基丁酸產(chǎn)量影響因素及代謝途徑的研究[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

4 聶夢云;煙草萜類代謝途徑相關(guān)基因的克隆及功能分析[D];西南大學(xué);2016年

5 譚小琴;珠江水體硫氧化細(xì)菌多樣性及其硫代謝途徑研究[D];華南理工大學(xué);2016年

6 潘志宏;植物化感作用代謝途徑模擬預(yù)測系統(tǒng)的構(gòu)建與應(yīng)用[D];福建農(nóng)林大學(xué);2009年

7 皮文清;Dyella ginsengisoli LA-4中聯(lián)苯降解基因簇的轉(zhuǎn)錄及代謝途徑研究[D];大連理工大學(xué);2011年

8 郝雪英;‘魯紅1號’元寶楓的葉色表現(xiàn)及其MYB轉(zhuǎn)錄因子的基因克隆[D];山東農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 單天雷;小麥MYB轉(zhuǎn)錄因子TaMYB86和TaRIM1的分子特征與防御功能分析[D];中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院;2016年

10 高凌云;西瓜低溫響應(yīng)MYB（Cla007586）轉(zhuǎn)錄因子的功能鑒定及互作蛋白分析[D];華中農(nóng)業(yè)大學(xué);2016年

本文編號：2866961